Portal InstitucionalUFPEL

A reserva ovariana pode ser compreendida como o conjunto de todos folículos ovarianos potencialmente disponíveis para fertilização durante a vida feminina e é representada principalmente por folículos primordiais (1). Por sua vez, o número de folículos ovarianos é determinado ainda durante a vida intrauterina da mulher e o constante recrutamento leva ao esgotamento e término da vida reprodutiva, ocasionando também uma série de alterações na fisiologia feminina as quais são marcadas pela redução das concentrações de estrógenos, aumento do risco cardiometabólico, redução da saúde óssea, aumento da incidência de transtornos mentais e outras condições patológicas (2, 3). Aspectos genéticos e ambientais como avanço da idade, dieta, sedentarismo, tabagismo e condições inflamatórias também podem impactar no processo de envelhecimento ovariano e ativação folicular (4). Dessa forma, desde a segunda década de 1900 os primeiros estudos já apontavam para a restrição calórica (RC) como uma estratégia nutricional capaz de promover maior sustentabilidade da fertilidade e adiamento da menopausa em roedores (5). A RC de 40% durante 4 meses em camundongos adultos foi eficaz para reduzir o recrutamento folicular, onde as fêmeas do grupo RC apresentavam reserva ovariana duas vezes maior que os animais do grupo controle (6). Por sua vez, a modulação de vias intracelulares como do complexo mTORC1 e FOXO3 parecem ser o ponto central para os efeitos da RC sobre a reserva ovariana, determinando processos de ativação e dormência folicular, respectivamente (7, 8). Assim, a RC continua sendo estudada e atualmente sabe-se que quando aplicada em intensidades de até 30% a estratégia é eficaz para reduzir a ativação de folículos primordiais e promover extensão da vida reprodutiva feminina (8).
Interessantemente, estudos estão associando os efeitos da RC a partir da restrição de proteínas (RP), e especificamente de um seleto grupo de aminoácidos conhecidos como BCAAs (do inglês, branched chain amino acids), que é imposta pela estratégia (9). A substituição de proteínas por carboidratos, mesmo em dietas isocalóricas, favoreceu maior longevidade e otimização de marcadores de saúde, sugerindo que a longevidade e saúde metabólica seriam determinadas pela quantidade total de proteínas consumidas e não pela oferta energética (10). Da mesma maneira, a menor ingestão proteica (total de calorias provenientes de proteínas de 7%) e de BCAAs está demonstrou reduzir adiposidade total e promover maior sensibilidade à insulina em humanos e roedores (11). Fora isso, vias de detecção de nutrientes, como a mTOR e SIRT1, foram influenciadas pelos padrões dietéticos onde dietas baixas em proteínas e ricas em carboidratos (LPHC) reproduziram benefícios da RC no envelhecimento cerebral de camundongos (12).
Além disso, a ativação de folículos ovarianos foi reduzida pela restrição de proteínas (9% da ingestão energética total) e acelerada pelo consumo proteico aumentando (56% da energia proveniente de proteínas) quando comparados a dieta controle (22% da energia proveniente de proteínas), no qual a restrição ou excesso da ingestão de proteínas resultou em preservação ou declínio, respectivamente, do número de folículos ovarianos ao decorrer do envelhecimento (13). Em outra mão, outro estudo demonstrou que o número total de folículos ovarianos foi maior em fêmeas alimentadas em dietas com razão proteína:carboidrato de 3:1, contudo esse resultado foi apresentado de maneira descritiva e não apresentou justificativa em nenhuma via metabólica para tal (14). Ainda, é importante destacar que esses foram os únicos 2 estudos encontrados na literatura científica que avaliaram os efeitos da restrição de proteínas no envelhecimento ovariano. Por sua vez, os efeitos da restrição de proteínas na reserva ovariana pareceram ser principalmente atrelados a alterações na sinalização mTORC1 ovariana e de agente metabólicos periféricos como o fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21) e adiponectina (13). No entanto, esses mecanismos não estão totalmente elucidados e torna-se claro observar que mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos fisiológicos pelo qual a restrição de proteínas e de BCAAs poderia impactar na preservação da reserva ovariana, visto que há poucos estudos sobre.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), sendo aprovado sob o número 024998/2021-29. Para desenvolvimento deste projeto serão utilizados ao todo 36 animais com idade aproximada de 90 dias e fornecidos pelo Biotério da UFPel para serem mantidos no laboratório de Nutrição experimental da Faculdade de Nutrição UFPel. Os mesmos permanecerão sob condições controladas de temperatura e luz (22± 2ºC, ciclos 12 horas claro/12 horas escuro) em grupos de 3 animais por caixa com água a vontade. Estruturando o desenho de estudo, os animais serão randomizados igualmente em 4 grupos, sendo eles o grupo controle (n = 9), grupo restrição calórica de 30% (RC; n = 9), grupo restrição de proteínas (RP; n = 9) e grupo restrição de aminoácidos ramificados (RBCAAs; n = 9).
Manejo dos animais
Os animais serão monitorados quanto ao ganho de peso e consumo alimentar durante todo período de acomodação e intervenção do estudo. Para isso, cada camundongo será pesado individualmente em balança de precisão semanalmente e seu peso registrado em uma planilha de controle. Já o consumo alimentar será verificado a partir da diferença entre oferta e sobras na caixa semanalmente, onde a média semanal do consumo alimentar ad libitum dos camundongos durante o período de adaptação será utilizado para cálculo da oferta para primeira semana do estudo. Posteriormente, a oferta alimentar para camundongos do grupo RC será determinada pelo equivalente diário da média semanal dos animais do grupo controle apresentando redução de 10% na primeira, semana, 20% na segunda semana e 30% da quantidade fornecida da terceira semana em diante (15). Enquanto isso, animais do grupo controle, restrição de proteínas e de BCAAs terão consumo ad libitum das dietas. Os animais receberão as dietas por um período de 90 dias. Ao término do experimento, os animais serão eutanasiados após jejum de 4 horas e anestesia por via inalatória com isoflurano, realizando a exsanguinação por punção cardíaca seguida de deslocamento cervical. Dado isso, os camundongos serão dissecados e os ovários coletados e estocados, um ovário congelado a -80°C e outro em solução formaldeído a 10% para análise histológica.
Metabolismo da glicose
A sensibilidade periférica à insulina e função de células beta-pancreáticas serão avaliados a partir dos testes de tolerância à insulina (TTI) e teste de tolerância a glicose (TTG). Para isso, 15 dias antes da eutanásia será realizado o TTG com todos os animais do experimento, sendo administrado 2g de glicose por quilo corporal por meio de injeção intraperitoneal após 4 horas de jejum. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda dos animais mensurando os níveis de glicose sérica nos tempos de 0, 15, 30, 60 e 120 minutos pelo uso de um glicosímetro (AccuChek Active, Roche Diagnostics®, USA) (16). Ainda, o TTI será realizado 7 dias antes da eutanásia, também com todos animais do experimento, onde após 2 horas de jejum, os animais também receberão uma injeção intraperitoneal de insulina (0,5UI/kg de peso corporal) e terão sua glicemia monitorada nos tempos de 0, 5, 20 e 35 minutos de maneira similar ao executado durante o TTG (17).
Contagem de folículos ovarianos
Para avaliação histológica, as amostras ovarianas serão retiradas do paraformaldeído 10% e submetidas à desidratação em álcool, clareados em xilol e incluídos em Paraplast Plus (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Posteriormente, os ovários já incluídos em Paraplast Plus serão sequencialmente cortados em micrótomo automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK) em uma espessura de 5 μm, sendo que 1 a cada 6 cortes serão retirados e colocados em lâminas histológicas padrão. Além disso, cortes intermediários também serão separados para análise de imunofluorescência, usando lâminas silanadas em etanol com organosilano 3% (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Com isso feito e após a secagem das lâminas em estufa a 55°C, as mesmas serão coradas com hematoxilina-eosina, montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). Com a finalidade de avaliar a reserva ovariana em si, serão realizadas imagens de seções ovarianas capturadas por câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio (Nikon Eclipse E200, Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X. Por sua vez, a classificação dos folículos ovarianos será determinada da seguinte forma: primordiais quando cercados por uma camada de células da granulosa achatadas; primários quando cercados por uma camada de células da granulosa cubóides; secundários quando rodeados por duas ou mais camadas de células da granulosa cubóides; terciários quando a presença de antro e complexo cumulus oophorus for observada (18). Ainda por fim, a quantidade total de folículos encontrada será multiplicada por seis e posteriormente novamente multiplicada por dois, a fim de mimetizar a quantidade de folículos dos dois ovários.
Imunofluorescência
Após a desparafinização das amostras com xilol e reidratadas em concentrações de álcoois gradativas, será realizado o protocolo para imunofluorescência. Nesse sentindo, serão utilizados os anticorpos monoclonais primários para mTORC1 fosforilada e não fosforilada e FOXO3 fosforilada e não fosforilada, diluídos conforme a padronização de cada anticorpo. O procedimento de imunofluorescência será ajustado de acordo com o descrito anteriormente (19). Para análise, será utilizado de imagens dos folículos primordiais, primários e secundários capturadas com câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio Nikon Eclipse Ts2 (Nikon Corporation, JP), utilizando objetivas de 40X, sendo posteriormente utilizado de 5 oócitos/animal/folículo por grupo para gerar as médias. Os valores mais comuns (a moda) de cada área será registrada pelo aplicativo histograma 32-bit do software Image J®, utilizando uma escala que varia de 0 (a maior intensidade de coloração) a 255 (sem coloração).
Expressão gênica
Durante o momento da eutanásia um dos ovários de cada fêmea será dissociado pela ação da Colagenase tipo 1 (1 mg/ml, >125 unidade de digestão de colágeno por mg) e DNase (18 IU/ml) para isolamento de folículos pré-antrais permitindo sua análise específica (20). Após os foliculos isolados serão transferido para microtubos contendo 1mL de isotiocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA), sendo homogeneizado e armazenado à -70°C. O RNA total será quantificado por meio do uso do espectofotômetro (NanoDrop Lite, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), ajustando as amostras para 200 ng /µL. Ainda, as amostras terão sua pureza verificada através da taxa de absorbância de 260/280 nm.
O DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de e 1 μg de RNA total utilizando do kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), gerando o volume total de 20 µL, conforme as recomendações do fabricante. A PCR em tempo real será realizada em duplicata, usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RTPCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sendo corridos 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação para cada ensaio, garantindo a amplificação de um único produto de PCR. Os genes usados para controle endógeno serão os genes beta-2 microglobulin (B2m) e actin beta (Actb) enquanto os genes alvos serão: RAC-alpha serine/threonine protein kinase 1 (Akt1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1 (Pik3r1), mechanistic target of rapamycin kinase (Mtor), forkhead box protein O3(Foxo3a), growth differentiation factor 9 (Gdf9), anti-Mullerian hormone (Amh), bone morphogenetic protein 15 (Bmp15), proto-oncogene receptor tyrosine kinase (Kit), Kit Ligand (Kitl), phosphatase and tensin homolog (Pten).
Para cálculo da expressão relativa de cada gene será utilizado do cálculo equação 2A-B/2C-D, onde o valor de A é o valor limiar do ciclo [CT] para o gene de interesse na primeira amostra do controle; B, o valor de Ct para o gene de interesse na amostra analisada; C, a média geométrica dos valores Ct para os genes B2M e ACTB na primeira amostra do controle e D, a média do Ct para os genes B2m e ACTB na amostra analisada (Masternak, Al-Regaiey et al. 2005).
Análises estatísticas
Para realizar as análises estatísticas será utilizado o software Graphpad Prism 6.0, no qual será utilizado do teste One Way ANOVA seguido de um post-hoc de Tukey para avaliar a contagem de folículos, imunofluorescência e expressão gênica. Enquanto o metabolismo da glicose, ganho de peso e consumo alimentar serão analisados por Two way ANOVA de medidas repetidas. Valores de P<0,05 serão considerados significativamente estatísticos.

Espera-se que os achados deste trabalho indicarão para os possíveis efeitos positivos da restrição de proteínas e de BCAAs no envelhecimento ovariano, mimetizando os já conhecidos impactos da restrição calórica à reserva folicular ovariana e possibilitando o desenvolvimento de uma nova estratégia dietética que aumente a qualidade de vida e entregue efeitos protetivos e benéficos a saúde de mulheres. Dessa forma, a partir da conclusão desse trabalho espera-se contribuir para a comunidade científica, e posteriormente, do direcionamento e tomada de decisão de profissionais da área da saúde, órgãos governamentais e sociedade como todo. A meta é a formação de 1 mestre e publicação de um artigo cientifico em periódico internacional.