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A senescência celular é definida como uma resposta celular que limita a divisão de células envelhecidas ou danificadas (MUNOZ-ESPIN; SERRANO, 2014). A senescência exerce papéis fisiológicos durante o desenvolvimento normal e é essencial para a homeostase tecidual (MCHUGH; GIL, 2018). Trata-se de um processo que é projetado principalmente para eliminar células indesejadas através do recrutamento de células imunes, induzindo remodelação do tecido, em resposta ao estresse desencadeado por danos associados ao envelhecimento, como a instabilidade genômica e o desgaste dos telômeros, que são sinais específicos do envelhecimento (MCHUGH; GIL, 2018). No entanto, o acúmulo crônico de células senescentes que ocorre com o avançar da idade, resulta em potenciais efeitos prejudiciais à saúde como doenças relacionadas à idade (SUN; YOULE; FINKEL, 2016), ou seja, a senescência celular é um estado induzido pelo estresse de parada estável do crescimento, que está fortemente associada ao envelhecimento, porém também presente na obesidade. A senescência parece ser um mecanismo central de doenças relacionadas à idade, mas pode ser ativada de forma prematura pelos mediadores da obesidade (TREFF; KRISHER; TAO; GARNSEY et al.). Sabe-se que a obesidade causa estresse oxidativo e inflamação (TREFF; KRISHER; TAO; GARNSEY et al.), e com isso pode aumentar de forma progressiva o encurtamento de telômeros que é um marcador biológico do envelhecimento. A obesidade não apenas contribui para o aparecimento de desordens metabólicas, mas também afeta os processos a nível celular de maneira semelhante ao envelhecimento, dessa forma acelerando-o (AHIMA, 2009). Uma vez formada, as células senescentes podem contribuir para um maior estado inflamatório e estresse oxidativo do tecido, causando resistência à insulina através da secreção de SASP constituído por metaloproteínases (MMP-1, MMP-3, MMP-10), citocinas (IL-6,IL-8) e fatores de crescimento (IGFBPs) dentre outros (JAN; CERVERA; MAACHI; BAUDRIMONT et al.). Na obesidade as células senescentes contribuem para que os macrófagos sejam atraídos a migrar para o tecido adiposo visceral. Em camundongos obesos com idade avançada há uma quantidade consideravelmente maior de células senescentes quando comparado a animais selvagens. Desta maneira, podemos entender que a obesidade acelera a senescência celular e seus impactos negativos no organismo.
Uma classe de medicamentos relativamente nova, as drogas senolíticas, são capazes de remover de forma seletiva as células senescentes do organismo, retardando o envelhecimento, e seus sintomas (XU; PIRTSKHALAVA; FARR; WEIGAND et al., 2018). Dentre os senolíticos que estão sendo mais estudados no momento, estão o dasatinib e a quercetina (D+Q) (ZHU; XU; YANG; LI, 2009), que são muito eficazes na remoção de alguns tipos de células senescentes (ZHU; XU; YANG; LI, 2009). A quercetina é um dos principais bioflavonóides que estão presentes na dieta humana, já o dasatinib, é um inibidor de múltiplas tirosinas quinases, utilizado em tratamentos oncológicos (MONTERO; SEOANE; OCANA; PANDIELLA, 2011). Estudo recente identificou que, em camundongos, o tratamento com a combinação dessas drogas (D+Q) reduziu de forma seletiva o número de células senescentes e sintomas que são característicos do envelhecimento, aumentando a longevidade desses animais (XU; PIRTSKHALAVA; FARR; WEIGAND et al., 2018). Outro estudo testou estes compostos senolíticos em humanos, pacientes com fibrose pulmonar idiopática, observando redução de sintomas após 3 semanas de tratamento (JUSTICE et al. 2019). Existem outros senolíticos que vem demonstrando resultados benéficos, como por exemplo, a Fisetina que também é um flavonóide natural encontrado em muitas frutas e vegetais, e pode induzir apoptose em células senescentes (ZHU et al., 2020).
Quando as células senescentes são removidas através do tratamento com D+Q, há uma diminuição na inflamação e um aumento na sensibilidade à insulina, aumentando a longevidade de animais normais (XU et al. 2018). Em animais obesos que possuem uma alta carga de células senescentes, aumentando o ambiente pró-inflamatório, esses animais quando tratados com senolíticos foi possível observar uma depuração das células senescentes, junto com uma melhora na disfunção metabólica relacionada à obesidade e suas complicações (PALMER et al. 2019). Assim fica claro que os senolíticos tem uma importância no tratamento das comorbidades associadas à obesidade e idade.
Visto que as células senescentes estão presentes em diversos tecidos (Hayflik, 1961; Hohn et al., 2017; Tchkonia et al., 2010), há uma escassez na literatura de dados sobre a presença de células senescentes em órgãos reprodutores de mamíferos e é possível que o sistema reprodutor feminino e masculino também seja alvo de células senescentes, principalmente com o avançar da idade. Desta forma, um atraso na depleção de oócitos da reserva ovariana, ou seja, na ativação de folículos primordiais bem como a manutenção de sua qualidade seriam essenciais para prolongar a fertilidade feminina e reduzir o risco de anormalidades cromossômicas e morte embrionária precoce relacionada com a aproximação da menopausa (Treff et al., 2016). Em contrapartida, de forma menos marcada, a fertilidade nos machos não parece sofrer tão drástica queda. Os túbulos seminíferos, possuem as únicas células do organismo que não param de se dividir, permanecendo sempre com uma reserva – as espermatogônias (Sharma e Agarwal, 2011). As espermatogônias são as células responsáveis pela produção dos espermatozoides, gameta masculino (Loveland, 2014). Essas células são dependentes das células de Sertoli para a sua nutrição e das células de Leydig, responsáveis pela produção de testosterona (Loveland, 2014). A testosterona é o principal hormônio sexual masculino e é indispensável para manter a espermatogênese, esse processo ainda não está totalmente esclarecido, porém a diminuição dos níveis de testosterona nos testículos está relacionada com a diminuição da produção de espermatozoides (Smith e Walker, 2014). No envelhecimento há um declínio progressivo dos níveis de testosterona caracterizado pela andropausa, além do envelhecimento outros fatores podem contribuir para a diminuição dos níveis de testosterona como a dieta rica em gordura, obesidade e resistência a insulina, por exemplo (Volek et al., 2001; Nandy et al., 2008). Tanto o envelhecimento como obesidade e resistência à insulina podem contribuir para aumento das células senescentes nos tecidos.
A exposição prolongada, à uma dieta hiperlipídica em camundongos adultos jovens, que não desenvolveram obesidade, causa uma significativa redução no número total de folículos primordiais, maior quantidade de citocinas pró- inflamatórias sistêmicas e o aumento da infiltração de macrófagos no ovário, obtendo assim uma má qualidade dos oócitos que acarreta em fertilidade comprometida, anormalidades cromossômicas além de perdas gestacionais (Skaznik-Wikiel et al., 2016), já camundongos expostos por 4 semanas à essa mesma dieta, os oócitos e células do cumulus já continham marcações aumentadas de lipídios neutros (Wu et al., 2010), e por um período exposição de 6 semanas mostrou ter efeito irreversível na qualidade dos oócitos (Reynolds et al., 2015). A obesidade induzida por dieta hiperlipídica possuem efeitos oposto através das mesmas vias que a restrição calórica, ou seja, por meio da ativação do mTOR e da supressão da sinalização SIRT1, aumentando assim a ativação dos folículos primordiais, e esgotando precocemente a reserva ovariana (Wang et al., 2014). Portanto, estudos com camundongos apontam que o alto consumo de gordura na dieta pode influenciar algumas funções reprodutivas independentes da obesidade (Robker et al., 2009).

Experimento com as fêmeas
Serão utilizados 152 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com idade de 90 dias que serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Os animais inicialmente serão divididos em 2 grupos, sendo que o grupo controle (n=76) receberá água e dieta padrão ad libitum durante toda a duração do experimento e o grupo tratamento (n=76) receberá água e dieta ocidental ad libitum até completar 6 meses. Aos 6 meses de idade 5 animais de cada grupo dieta ocidental e dieta padrão serão eutanasiados, dissecados e ovário, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas. O restante dos animais dos grupos dieta padrão e ocidental serão divididos em quatro grupos (n=35) em cada, receberão via gavagem dasatinib (5 mg/kg) e quercetina (50 mg/kg) (Xu et al. 2018) uma vez a cada trinta dias. Aos 9 meses de idade, 6 animais de cada grupo serão eutanasiados, dissecados e ovário, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas, e o restante serão acasaladas com camundongos machos (sem receber nenhum tratamento) de 3 meses de idade para verificar a taxa de prenhez e número de filhotes por ninhada em cada grupo. As fêmeas serão pesadas a cada duas semanas durante todo o período do experimento. Durante todo o experimento os camundongos serão observados diariamente para sinais clínicos de prostração, alimentação adequada através do ganho de peso individual.
Experimento com os machos
Para o experimento com os machos serão utilizados 131 camundongos da linhagem C57BL/6 com 3 meses de idade. que serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Inicialmente os animais serão divididos em 2 grupos, sendo que o grupo controle (n=65) receberá água e dieta padrão ad libitum durante toda a duração do experimento e o grupo tratamento (n=66) receberá água e dieta ocidental ad libitum até completar 6 meses. Aos 6 meses de idade 5 animais de cada grupo dieta ocidental e dieta padrão serão eutanasiados, dissecados e testículos, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas. O restante dos animais dos grupos dieta padrão e ocidental serão divididos em seis grupos (n=18), onde os grupos (dieta padrão D+Q e dieta ocidental D+Q) receberão via gavagem dasatinib (5 mg/kg) e quercetina (50 mg/kg) (Xu et al. 2018) os grupos (Dieta padrão FIS e dieta ocidental FIS) e 100mg/kg de fisetina 96% (TCI, America™, Tokio) (LAB), dissolvida previamente em 60% Phosal 50 PG:30%PEG400:10% etanol, conforme o protocolo que observou que essa dosagem em camundongos havia efeito senolítico (YOUSEFZADEH et al., 2018) e os grupos (dieta padrão CTL e dieta ocidental CTL) receberão placebo. uma vez a cada trinta dias. Aos 9 meses de idade, 6 animais de cada grupo serão eutanasiados, dissecados e testículos, epidídimos, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas, e com restante será feito teste de acasalamento com os machos aos 9 meses de idade na proporção de 1 macho para 2 fêmeas (não tratadas).
Avaliação histológica
Os ovários dos camundongos serão coletados e fixados em paraformaldeído a 4%, desidratados em uma bateria de álcool, diafanizados com xilol e posteriormente incluídos em paraplast. Os ovários serão seccionados a uma espessura de 5 µm com um micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Os ovários serão selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. Todo o ovário será cortado e utilizado. As lâminas, após secagem na estufa a 56°C por 24 horas, serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X. Os folículos quantificados serão aqueles que apresentaram o núcleo dos oócitos claramente visível. A quantidade final de folículos será multiplicada duas vezes, mimetizando a quantidade de folículos dos dois ovários e será multiplicada por seis para contabilizar a amostragem por seção.
Os testículos e epidídimos dos camundongos serão coletados e fixados em paraformaldeído 4%, desidratados em uma bateria de álcool, diafanizados com xilol e posteriormente incluídos em paraplast. Os tecidos serão seccionados a uma espessura de 5 µm com um micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Os ovários serão selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. Todo o ovário será cortado e utilizado. As lâminas, após secagem na estufa a 56°C por 24 horas, serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X.
Análise morfométrica dos túbulos seminíferos e regiões epididimárias será feita realizando secções coradas com hematoxilina e eosina, serão visualizadas num microscópio óptico acoplado a uma câmera digital, serão obtidas a partir da análise e quantificação dos túbulos seminíferos e epididimários. Cinquenta túbulos seminíferos serão capturados após a seleção dos túbulos mais arredondados de acordo com os critérios de Leblond e Clermont (1952). Dos túbulos epididimários, 20 túbulos da cabeça, corpo e cauda serão capturados aleatoriamente. Todas as imagens serão digitalizadas para a área total (TA) e área luminal (AE), diâmetro total (DT) e luminal (DL) e altura epitelial (AE), e serão analisadas usando software especifico, de acordo com (Correia et al., 2019).
Teste enzimático da Beta-Galactosidase
Será realizado o teste enzimático para avaliar a atividade da beta-galactosidase através do kit comercial da Thermo Scientifc Mammalian beta-Galactosidase Assay Kit (catálgo 75707). Serão utilizados ovários e testículos congelados coletados em seguida da eutanásia para a realização do teste e seguindo as instruções do fabricante para a realização do protocolo.
Teste de intolerância à insulina e Teste de tolerância a glicose
Na semana anterior de cada eutanasia será realizado o Teste de Tolerância à Insulina (TTI) e o Teste de Tolerância à Glicose (TTG). Os camundongos de cada grupo serão divididos e 10 animais farão o TTI e 10 o TTG. O TTI será feito para avaliar a sensibilidade periférica à insulina e o metabolismo da glicose. Será administrada a dose de 1/2 UI/kg de peso corporal de insulina intraperitonealmente após duas horas de jejum. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos: 0, 5, 20, 35 e 60 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímetro (AccuChek Activ, Roche Diagnostics®, USA) (Fang et al., 2013). O TTG será feito para avaliar a resistência à insulina e o metabolismo da glicose. Será administrado 2g de glicose/kg de peso corporal intraperitonealmente nas fêmeas após 4h de jejum. O sangue também será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímentro (Bennis et al., 2017).
Analise de expressão gênica
A extração do RNA dos testículos será feita pelo método do Trizol, conforme o seu protocolo. O RNA final será então dissolvido em 20 uL de água livre de ribonucleases e sua concentração estimada por espectrofotometria. As amostras obtidas serão guardadas à -80ºC até sua utilização. Para expressão de mRNA o DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de 1 μg de RNA total com transcriptase reversa (iScript, Biorad) utilizando-se como iniciadores nucleotídeos hexâmeros aleatórios (RH). Após síntese de cDNA, as amostras serão submetidas a análise de PCR em tempo real para análise da expressão dos genes relacionados com as vias de sinalização intracelulares e proteínas envolvidas no funcionamento do testículo: proteína quinase B (AKT1), fosfoinositídeo-3-quinase (PI3k), alvo de sinalização mamífero da rapamicina (mTOR), Sirtuina 1 (SIRT1), Superóxido dismutase 2 (SOD2) e Catalase (CAT) genes relacionados com a espermatogênese: proteína morfogenética óssea 8B (BPM8B), HSP90 e fator de transcrição relacionado a doublesex e mab-3 1 (DMRT1) e finalmente, genes relacionados com a senescência celular: ligante NKG2D, p16ink4a, regulador anti-apoptótico PAI-2, efrina, p53 fosforilada, IL-1a, IL-6, Bcl-2, Bcl-xL, SAHF.Será utilizado β-2-microglobulina (β2M) e βACTINA como controles internos. O nível de expressão será calculado pelo método do delta, delta Ct, usando os controles internos como referência.
Motilidade e vigor espermático
Após 30 minutos de incubação, a motilidade dos espermatozoides na placa de pré-incubação contendo meio TYH será avaliada subjetivamente. A porcentagem de espermatozoides móveis e progressivos será graduada, com 2+ significando maior que 80% da motilidade; +, superior a 60% a 80% de motilidade; ±, maior que 40% a 60% de motilidade; e - menos de 40% de espermatozoides móveis. A concentração de esperma será determinada usando uma câmara de contagem de Neubauer.
Analise estatísticas
As análises estatísticas serão realizadas utilizando o software Graphpad Prism 6.0.

Esperamos que esse trabalho possa trazer novos dados a respeito de intervenções na preservação da fertilidade em longo prazo em animais alimentados com dieta ocidental. É um tema de extrema relevância, como a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos anos, juntamente com hábitos alimentares não saudáveis com alimentos ricos em gordura e açucares são prejudiciais à saúde, e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade são adiantadas com uma má alimentação, particularmente importantes em mulheres pós-menopausa, quando sua incidência aumenta drasticamente. Acreditamos que esta série de experimentos nos ajudará melhor entender o processo e as vias de sinalização intracelulares envolvidas no envelhecimento ovariano, testicular e na fertilidade, e também a ação dos senolíticos em animais alimentados com dieta ocidental. Esperamos publicar dois artigos científicos em revista internacional com base neste projeto. Esperamos a publicação de resumos em congresso internacionacionais e locais, além de publicações em revistas de circulação internacional.