Nome do Projeto
Efeitos da dieta ocidental na senescência celular em camundongos e papel protetor dos senolíticos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/09/2022 - 01/09/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
A expectativa de vida tem aumentado nos dias atuais, e com isso, as mulheres têm optado por adiar a maternidade, acarretando na necessidade do prolongamento da vida reprodutiva feminina, de forma saudável. Em contraponto a longevidade há uma transição alimentar que vem modificando os hábitos alimentares da população, maior consumo de dieta com alta densidade calórica, como a dieta ocidental que se caracteriza por ser rica em gorduras saturadas, carboidratos refinados e sal. Essa dieta tem sido associada ao aumento da prevalência de distúrbios metabólicos, incluindo obesidade, diabetes outras condições associadas. A dieta ocidental leva uma antecipação e agravamento das comorbidades associadas ao envelhecimento. A obesidade em homens como tem sido associado a um nível mais baixo de testosterona, pior qualidade do esperma e redução da fertilidade em comparação com homens de peso normal. Em mulheres está associada a problemas reprodutivos, acelera gasto da reserva ovariana, que também são observados como consequência do envelhecimento natural. Tanto o envelhecimento como a obesidade levam a um aumento na proporção de células senescentes em diferentes tecidos do organismo. Essas células possuem como características a secreção de fatores pró-inflamatórios que atraem macrófagos, ou seja, este estado de parada proliferativa estável é acompanhado pelo fenótipo secretor associado a senescência (SASP), que envolve a secreção de sinais pró-inflamatórios no microambiente do tecido. Este acúmulo de células senescentes acaba por ser prejudicial ao organismo e associado ao declínio das funções corporais durante o envelhecimento. No entanto, são limitados os dados, reportando presença ou não de células senescentes em órgãos reprodutores. Assim, nosso estudo visa melhor entender o papel da dieta ocidental na regulação do envelhecimento ovariano e testicular, visando preservar a fertilidade e prevenir acumulo de células senescentes em órgãos reprodutores através do tratamento com senolíticos.

Objetivo Geral

Avaliar o efeito do tratamento com senolíticos na fertilidade e no envelhecimento testicular e ovariano de machos e fêmeas tratados com dieta ocidental.

Justificativa

A senescência celular é definida como uma resposta celular que limita a divisão de células envelhecidas ou danificadas (MUNOZ-ESPIN; SERRANO, 2014). A senescência exerce papéis fisiológicos durante o desenvolvimento normal e é essencial para a homeostase tecidual (MCHUGH; GIL, 2018). Trata-se de um processo que é projetado principalmente para eliminar células indesejadas através do recrutamento de células imunes, induzindo remodelação do tecido, em resposta ao estresse desencadeado por danos associados ao envelhecimento, como a instabilidade genômica e o desgaste dos telômeros, que são sinais específicos do envelhecimento (MCHUGH; GIL, 2018). No entanto, o acúmulo crônico de células senescentes que ocorre com o avançar da idade, resulta em potenciais efeitos prejudiciais à saúde como doenças relacionadas à idade (SUN; YOULE; FINKEL, 2016), ou seja, a senescência celular é um estado induzido pelo estresse de parada estável do crescimento, que está fortemente associada ao envelhecimento, porém também presente na obesidade. A senescência parece ser um mecanismo central de doenças relacionadas à idade, mas pode ser ativada de forma prematura pelos mediadores da obesidade (TREFF; KRISHER; TAO; GARNSEY et al.). Sabe-se que a obesidade causa estresse oxidativo e inflamação (TREFF; KRISHER; TAO; GARNSEY et al.), e com isso pode aumentar de forma progressiva o encurtamento de telômeros que é um marcador biológico do envelhecimento. A obesidade não apenas contribui para o aparecimento de desordens metabólicas, mas também afeta os processos a nível celular de maneira semelhante ao envelhecimento, dessa forma acelerando-o (AHIMA, 2009). Uma vez formada, as células senescentes podem contribuir para um maior estado inflamatório e estresse oxidativo do tecido, causando resistência à insulina através da secreção de SASP constituído por metaloproteínases (MMP-1, MMP-3, MMP-10), citocinas (IL-6,IL-8) e fatores de crescimento (IGFBPs) dentre outros (JAN; CERVERA; MAACHI; BAUDRIMONT et al.). Na obesidade as células senescentes contribuem para que os macrófagos sejam atraídos a migrar para o tecido adiposo visceral. Em camundongos obesos com idade avançada há uma quantidade consideravelmente maior de células senescentes quando comparado a animais selvagens. Desta maneira, podemos entender que a obesidade acelera a senescência celular e seus impactos negativos no organismo.
Uma classe de medicamentos relativamente nova, as drogas senolíticas, são capazes de remover de forma seletiva as células senescentes do organismo, retardando o envelhecimento, e seus sintomas (XU; PIRTSKHALAVA; FARR; WEIGAND et al., 2018). Dentre os senolíticos que estão sendo mais estudados no momento, estão o dasatinib e a quercetina (D+Q) (ZHU; XU; YANG; LI, 2009), que são muito eficazes na remoção de alguns tipos de células senescentes (ZHU; XU; YANG; LI, 2009). A quercetina é um dos principais bioflavonóides que estão presentes na dieta humana, já o dasatinib, é um inibidor de múltiplas tirosinas quinases, utilizado em tratamentos oncológicos (MONTERO; SEOANE; OCANA; PANDIELLA, 2011). Estudo recente identificou que, em camundongos, o tratamento com a combinação dessas drogas (D+Q) reduziu de forma seletiva o número de células senescentes e sintomas que são característicos do envelhecimento, aumentando a longevidade desses animais (XU; PIRTSKHALAVA; FARR; WEIGAND et al., 2018). Outro estudo testou estes compostos senolíticos em humanos, pacientes com fibrose pulmonar idiopática, observando redução de sintomas após 3 semanas de tratamento (JUSTICE et al. 2019). Existem outros senolíticos que vem demonstrando resultados benéficos, como por exemplo, a Fisetina que também é um flavonóide natural encontrado em muitas frutas e vegetais, e pode induzir apoptose em células senescentes (ZHU et al., 2020).
Quando as células senescentes são removidas através do tratamento com D+Q, há uma diminuição na inflamação e um aumento na sensibilidade à insulina, aumentando a longevidade de animais normais (XU et al. 2018). Em animais obesos que possuem uma alta carga de células senescentes, aumentando o ambiente pró-inflamatório, esses animais quando tratados com senolíticos foi possível observar uma depuração das células senescentes, junto com uma melhora na disfunção metabólica relacionada à obesidade e suas complicações (PALMER et al. 2019). Assim fica claro que os senolíticos tem uma importância no tratamento das comorbidades associadas à obesidade e idade.
Visto que as células senescentes estão presentes em diversos tecidos (Hayflik, 1961; Hohn et al., 2017; Tchkonia et al., 2010), há uma escassez na literatura de dados sobre a presença de células senescentes em órgãos reprodutores de mamíferos e é possível que o sistema reprodutor feminino e masculino também seja alvo de células senescentes, principalmente com o avançar da idade. Desta forma, um atraso na depleção de oócitos da reserva ovariana, ou seja, na ativação de folículos primordiais bem como a manutenção de sua qualidade seriam essenciais para prolongar a fertilidade feminina e reduzir o risco de anormalidades cromossômicas e morte embrionária precoce relacionada com a aproximação da menopausa (Treff et al., 2016). Em contrapartida, de forma menos marcada, a fertilidade nos machos não parece sofrer tão drástica queda. Os túbulos seminíferos, possuem as únicas células do organismo que não param de se dividir, permanecendo sempre com uma reserva – as espermatogônias (Sharma e Agarwal, 2011). As espermatogônias são as células responsáveis pela produção dos espermatozoides, gameta masculino (Loveland, 2014). Essas células são dependentes das células de Sertoli para a sua nutrição e das células de Leydig, responsáveis pela produção de testosterona (Loveland, 2014). A testosterona é o principal hormônio sexual masculino e é indispensável para manter a espermatogênese, esse processo ainda não está totalmente esclarecido, porém a diminuição dos níveis de testosterona nos testículos está relacionada com a diminuição da produção de espermatozoides (Smith e Walker, 2014). No envelhecimento há um declínio progressivo dos níveis de testosterona caracterizado pela andropausa, além do envelhecimento outros fatores podem contribuir para a diminuição dos níveis de testosterona como a dieta rica em gordura, obesidade e resistência a insulina, por exemplo (Volek et al., 2001; Nandy et al., 2008). Tanto o envelhecimento como obesidade e resistência à insulina podem contribuir para aumento das células senescentes nos tecidos.
A exposição prolongada, à uma dieta hiperlipídica em camundongos adultos jovens, que não desenvolveram obesidade, causa uma significativa redução no número total de folículos primordiais, maior quantidade de citocinas pró- inflamatórias sistêmicas e o aumento da infiltração de macrófagos no ovário, obtendo assim uma má qualidade dos oócitos que acarreta em fertilidade comprometida, anormalidades cromossômicas além de perdas gestacionais (Skaznik-Wikiel et al., 2016), já camundongos expostos por 4 semanas à essa mesma dieta, os oócitos e células do cumulus já continham marcações aumentadas de lipídios neutros (Wu et al., 2010), e por um período exposição de 6 semanas mostrou ter efeito irreversível na qualidade dos oócitos (Reynolds et al., 2015). A obesidade induzida por dieta hiperlipídica possuem efeitos oposto através das mesmas vias que a restrição calórica, ou seja, por meio da ativação do mTOR e da supressão da sinalização SIRT1, aumentando assim a ativação dos folículos primordiais, e esgotando precocemente a reserva ovariana (Wang et al., 2014). Portanto, estudos com camundongos apontam que o alto consumo de gordura na dieta pode influenciar algumas funções reprodutivas independentes da obesidade (Robker et al., 2009).

Metodologia

Experimento com as fêmeas
Serão utilizados 152 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com idade de 90 dias que serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Os animais inicialmente serão divididos em 2 grupos, sendo que o grupo controle (n=76) receberá água e dieta padrão ad libitum durante toda a duração do experimento e o grupo tratamento (n=76) receberá água e dieta ocidental ad libitum até completar 6 meses. Aos 6 meses de idade 5 animais de cada grupo dieta ocidental e dieta padrão serão eutanasiados, dissecados e ovário, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas. O restante dos animais dos grupos dieta padrão e ocidental serão divididos em quatro grupos (n=35) em cada, receberão via gavagem dasatinib (5 mg/kg) e quercetina (50 mg/kg) (Xu et al. 2018) uma vez a cada trinta dias. Aos 9 meses de idade, 6 animais de cada grupo serão eutanasiados, dissecados e ovário, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas, e o restante serão acasaladas com camundongos machos (sem receber nenhum tratamento) de 3 meses de idade para verificar a taxa de prenhez e número de filhotes por ninhada em cada grupo. As fêmeas serão pesadas a cada duas semanas durante todo o período do experimento. Durante todo o experimento os camundongos serão observados diariamente para sinais clínicos de prostração, alimentação adequada através do ganho de peso individual.
Experimento com os machos
Para o experimento com os machos serão utilizados 131 camundongos da linhagem C57BL/6 com 3 meses de idade. que serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Inicialmente os animais serão divididos em 2 grupos, sendo que o grupo controle (n=65) receberá água e dieta padrão ad libitum durante toda a duração do experimento e o grupo tratamento (n=66) receberá água e dieta ocidental ad libitum até completar 6 meses. Aos 6 meses de idade 5 animais de cada grupo dieta ocidental e dieta padrão serão eutanasiados, dissecados e testículos, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas. O restante dos animais dos grupos dieta padrão e ocidental serão divididos em seis grupos (n=18), onde os grupos (dieta padrão D+Q e dieta ocidental D+Q) receberão via gavagem dasatinib (5 mg/kg) e quercetina (50 mg/kg) (Xu et al. 2018) os grupos (Dieta padrão FIS e dieta ocidental FIS) e 100mg/kg de fisetina 96% (TCI, America™, Tokio) (LAB), dissolvida previamente em 60% Phosal 50 PG:30%PEG400:10% etanol, conforme o protocolo que observou que essa dosagem em camundongos havia efeito senolítico (YOUSEFZADEH et al., 2018) e os grupos (dieta padrão CTL e dieta ocidental CTL) receberão placebo. uma vez a cada trinta dias. Aos 9 meses de idade, 6 animais de cada grupo serão eutanasiados, dissecados e testículos, epidídimos, fígado e tecido adiposo serão coletados para futuras análises serão estocados a – 80ºC e em solução de PFA a 4% para análises histológicas, e com restante será feito teste de acasalamento com os machos aos 9 meses de idade na proporção de 1 macho para 2 fêmeas (não tratadas).
Avaliação histológica
Os ovários dos camundongos serão coletados e fixados em paraformaldeído a 4%, desidratados em uma bateria de álcool, diafanizados com xilol e posteriormente incluídos em paraplast. Os ovários serão seccionados a uma espessura de 5 µm com um micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Os ovários serão selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. Todo o ovário será cortado e utilizado. As lâminas, após secagem na estufa a 56°C por 24 horas, serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X. Os folículos quantificados serão aqueles que apresentaram o núcleo dos oócitos claramente visível. A quantidade final de folículos será multiplicada duas vezes, mimetizando a quantidade de folículos dos dois ovários e será multiplicada por seis para contabilizar a amostragem por seção.
Os testículos e epidídimos dos camundongos serão coletados e fixados em paraformaldeído 4%, desidratados em uma bateria de álcool, diafanizados com xilol e posteriormente incluídos em paraplast. Os tecidos serão seccionados a uma espessura de 5 µm com um micrótomo semi-automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). Os ovários serão selecionados 1 a cada 6 cortes e colocados em lâminas histológicas padrão. Todo o ovário será cortado e utilizado. As lâminas, após secagem na estufa a 56°C por 24 horas, serão coradas por hematoxilina-eosina e montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). As imagens dos cortes ovarianos serão capturadas por uma câmera digital Moticam 5.0 (Motic®, Hong Kong, China) acoplada a um microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X.
Análise morfométrica dos túbulos seminíferos e regiões epididimárias será feita realizando secções coradas com hematoxilina e eosina, serão visualizadas num microscópio óptico acoplado a uma câmera digital, serão obtidas a partir da análise e quantificação dos túbulos seminíferos e epididimários. Cinquenta túbulos seminíferos serão capturados após a seleção dos túbulos mais arredondados de acordo com os critérios de Leblond e Clermont (1952). Dos túbulos epididimários, 20 túbulos da cabeça, corpo e cauda serão capturados aleatoriamente. Todas as imagens serão digitalizadas para a área total (TA) e área luminal (AE), diâmetro total (DT) e luminal (DL) e altura epitelial (AE), e serão analisadas usando software especifico, de acordo com (Correia et al., 2019).
Teste enzimático da Beta-Galactosidase
Será realizado o teste enzimático para avaliar a atividade da beta-galactosidase através do kit comercial da Thermo Scientifc Mammalian beta-Galactosidase Assay Kit (catálgo 75707). Serão utilizados ovários e testículos congelados coletados em seguida da eutanásia para a realização do teste e seguindo as instruções do fabricante para a realização do protocolo.
Teste de intolerância à insulina e Teste de tolerância a glicose
Na semana anterior de cada eutanasia será realizado o Teste de Tolerância à Insulina (TTI) e o Teste de Tolerância à Glicose (TTG). Os camundongos de cada grupo serão divididos e 10 animais farão o TTI e 10 o TTG. O TTI será feito para avaliar a sensibilidade periférica à insulina e o metabolismo da glicose. Será administrada a dose de 1/2 UI/kg de peso corporal de insulina intraperitonealmente após duas horas de jejum. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos: 0, 5, 20, 35 e 60 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímetro (AccuChek Activ, Roche Diagnostics®, USA) (Fang et al., 2013). O TTG será feito para avaliar a resistência à insulina e o metabolismo da glicose. Será administrado 2g de glicose/kg de peso corporal intraperitonealmente nas fêmeas após 4h de jejum. O sangue também será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda nos seguintes tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a injeção de insulina e os níveis de glicose serão mensurados com um glicosímentro (Bennis et al., 2017).
Analise de expressão gênica
A extração do RNA dos testículos será feita pelo método do Trizol, conforme o seu protocolo. O RNA final será então dissolvido em 20 uL de água livre de ribonucleases e sua concentração estimada por espectrofotometria. As amostras obtidas serão guardadas à -80ºC até sua utilização. Para expressão de mRNA o DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de 1 μg de RNA total com transcriptase reversa (iScript, Biorad) utilizando-se como iniciadores nucleotídeos hexâmeros aleatórios (RH). Após síntese de cDNA, as amostras serão submetidas a análise de PCR em tempo real para análise da expressão dos genes relacionados com as vias de sinalização intracelulares e proteínas envolvidas no funcionamento do testículo: proteína quinase B (AKT1), fosfoinositídeo-3-quinase (PI3k), alvo de sinalização mamífero da rapamicina (mTOR), Sirtuina 1 (SIRT1), Superóxido dismutase 2 (SOD2) e Catalase (CAT) genes relacionados com a espermatogênese: proteína morfogenética óssea 8B (BPM8B), HSP90 e fator de transcrição relacionado a doublesex e mab-3 1 (DMRT1) e finalmente, genes relacionados com a senescência celular: ligante NKG2D, p16ink4a, regulador anti-apoptótico PAI-2, efrina, p53 fosforilada, IL-1a, IL-6, Bcl-2, Bcl-xL, SAHF.Será utilizado β-2-microglobulina (β2M) e βACTINA como controles internos. O nível de expressão será calculado pelo método do delta, delta Ct, usando os controles internos como referência.
Motilidade e vigor espermático
Após 30 minutos de incubação, a motilidade dos espermatozoides na placa de pré-incubação contendo meio TYH será avaliada subjetivamente. A porcentagem de espermatozoides móveis e progressivos será graduada, com 2+ significando maior que 80% da motilidade; +, superior a 60% a 80% de motilidade; ±, maior que 40% a 60% de motilidade; e - menos de 40% de espermatozoides móveis. A concentração de esperma será determinada usando uma câmara de contagem de Neubauer.
Analise estatísticas
As análises estatísticas serão realizadas utilizando o software Graphpad Prism 6.0.

Indicadores, Metas e Resultados

Esperamos que esse trabalho possa trazer novos dados a respeito de intervenções na preservação da fertilidade em longo prazo em animais alimentados com dieta ocidental. É um tema de extrema relevância, como a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos anos, juntamente com hábitos alimentares não saudáveis com alimentos ricos em gordura e açucares são prejudiciais à saúde, e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade são adiantadas com uma má alimentação, particularmente importantes em mulheres pós-menopausa, quando sua incidência aumenta drasticamente. Acreditamos que esta série de experimentos nos ajudará melhor entender o processo e as vias de sinalização intracelulares envolvidas no envelhecimento ovariano, testicular e na fertilidade, e também a ação dos senolíticos em animais alimentados com dieta ocidental. Esperamos publicar dois artigos científicos em revista internacional com base neste projeto. Esperamos a publicação de resumos em congresso internacionacionais e locais, além de publicações em revistas de circulação internacional.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AUGUSTO SCHNEIDER2
BIANCA MACHADO DE AVILA
BIANKA MACHADO ZANINI
CARLOS CASTILHO DE BARROS2
CESAR AUGUSTO PINZON OSORIO
DRIELE NESKE GARCIA
FABIOLA DA SILVA RODRIGUES
GABRIEL BARRETO VEIGA
GABRIEL SARAIVA COELHO
JULIANE BRISTOT PROSCZEK
JÉSSICA DAMÉ HENSE
LUIZA DE OLIVEIRA REZENDE PINHO
MARIANA MACHADO BARRETO
RENATA PEREIRA RAMIREZ2

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 5.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 5.000,00

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