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Durante o século passado, a maior parte dos estudos sobre taxonomia de Drosophilidae (Diptera)
concentrou-se na descrição da diversidade da família sem demonstrar que houvesse um método para
determinar suas relações filogenéticas (Sturtevant 1921, Duda 1925, Dobzhansky & Pavan 1943, Hsu
1949, Mourão et al. 1965, Kaneshiro 1969). Esse panorama se modificou na segunda metade do
século, onde estudos pioneiros como os de Throckmorton (1975) e, posteriormente, de Okada (1989)
e Grimaldi (1987, 1990) buscaram inferir o relacionamento filogenético de seus táxons.
Os estudos de Okada (1989) e Grimaldi (1987, 1990) acabaram por introduzir um novo paradigma
sobre o conhecimento das relações evolutivas de Drosophilidae. Eles incorporaram um conjunto de
análises filogenéticas mais formais, em que seus resultados ratificaram grupos taxonômicos
consagrados, propostos anteriormente somente com base em semelhanças das espécies que a
compunham. Isso permitiu a manutenção, tanto quanto possível, apenas de grupos monofiléticos
dentro da classificação da família. Ou seja, a classificação da família passou a ser um reflexo do
conhecimento filogenético do grupo, não apenas de agrupamentos constituídos com base em
semelhança. Os táxons genéricos da família foram reorganizados, com a proposição de novas
combinações ou mesmo a criação de novos táxons genéricos. Grimaldi (1990), com um amplo estudo
sobre as relações filogenéticas dos gêneros de Drosophilidae, resgata dois grandes clados em
Drosophilidae mantidos como subfamílias – Drosophilinae e Steganinae. Essas subfamílias foram
subdivididas em tribos. Em Drosophilinae, foram criados Cladochaetini e Drosophilini; em Steganinae,
foram criadas as tribos Steganini, Gitonini e Leucophengini.
Outra revolução nas abordagens sobre as relações evolutivas dentro de Drosophilidae ocorreu,
primeiramente, com a incorporação de ferramentas moleculares para a obtenção de novos
marcadores e, mais recentemente, com algoritmos precisos e rápidos, e com o aumento da
velocidade de processamento de dados nos computadores. Essa abordagem ganhou força nos
últimos 20 anos, com várias contribuições importantes à sistemática de Drosophilidae. A utilização de
ferramentas moleculares principalmente possibilitou a utilização de um novo conjunto de dados às
análises, que supostamente permitem agregar maior confiabilidade às relações filogenéticas
propostas (Russo et al. 1995) — ainda que, na prática, diferentes estudos moleculares dos mesmos
grupos taxonômicos, às vezes produzidos pelos mesmos laboratórios, venham mostrando resultados
muito incongruentes entre si. Além disso, elas avaliam aspectos que dificilmente poderiam ser
avaliados com caracteres, como a forma de herança, tempos de divergência, taxas de transição e
transversão, e relações históricas abaixo do nível de espécies (DeSalle & Grimaldi 1991).
As principais inferências sobre relações filogenéticas em Drosophilidae são o estabelecimento do
monofiletismo da família, bem como das suas duas subfamílias, Steganinae e Drosophilinae (Okada
1989, Grimaldi 1990, DeSalle & Grimaldi 1991). Além desses grandes clados, há conflitos entre
reconstruções diferentes, por exemplo a parafilia de Drosophila. Ainda que abordada por diversos
autores (Throckmorton 1975, Grimaldi 1990, Remsen & O’Grady 2002), essa questão ainda
permanece em aberto. A hipótese de parafilia de Drosophila resulta em diversas questões novas.
Houve recentemente uma série de discussões no “Bulletin of Zoological Nomenclature”, com
sugestões de alterações nas normas do Código Internacional de Nomenclatura Zoológica, para
mudança na espécie tipo do gênero Drosophila, tendo em vista a possibilidade de elevação de
Drosophila (Sophophora) à categoria de gênero e a transferência de Drosophila melanogaster para o
gênero Sophophora (van der Linde et al. 2007, O'Grady et al. 2008, Sidorenko 2008, Yassin 2008).
Há igualmente divergência quanto ao relacionamento entre outros gêneros, como no grupo-Zygothrica
de gêneros, em que Hirtodrosophila—antes subgênero de Drosophila), colocado em nível genérico
por Grimaldi (1990)—, Mycodrosophila e Zygothrica aparecem como subclados do subgênero
Drosophila (DeSalle & Grimaldi 1991, Kwiatowski & Ayala 1999, Remnsen & O’Grady 2002, DaLage et
al. 2007, van der Linde & Houle 2008, van der Linde et al. 2010). Hirtodrosophila, por sua vez, em
alguns trabalhos não aparece como monofilético (van der Linde et al. 2010). Paraliodrosophila e
Paramycodrosophila, também pertencentes ao grupo-Zygothrica. Esse grupo apresenta como
principais sinapomorfias a esclerotização da região posterior do cibarium, a presença de apenas um
ramo ventral na arista e de uma placa hipoproctal na região medial ventral dos cercos (Grimaldi 1990).
Segundo Grimaldi (1990), o grupo genérico Zygothrica parece ser proximamente relacionado aos
drosofilídeos havaianos, compondo com estes um clado basal dentro de Drosophilinae.
O posicionamento do grupo-Zygothrica, reconhecido como monofilético na análise de Grimaldi (1990)
e de Remsen & O’Grady (2002), e como parafilético por DaLage et al. (2007) e van der Linde et al.
(2008, 2010), é uma dos problemas não resolvidos de relações filogenéticas em drosofilídeos. Esse
grupo já havia sido inserido em Drosophila por Throckmorton (1975), mesmo sem a utilização de um
grande número de marcadores ou o uso métodos estatísticos sofisticados.
No estudo mais recente sobre filogenia de Drosophilidae, Yassin (2013), utilizando uma amostragem
taxonômica limitada e um número também restrito de genes e caracteres morfológicos, propõe a
sinonímia de três subgêneros de Drosophila (Chusqueophila, Phloridosa e Psilodorha) e a
sinonimização do gênero Palmophila ao subgênero Drosophila. Além disso, ressalta a parafilia de
Drosophila, mas evita sugerir modificações taxonômicas para não afetar os nomes genéricos
envolvendo as espécies mais utilizadas na literatura, como D. melanogaster. Yassin (2013) também
encontra as espécies de Hirtodrosophila, Mycodrosophila e Zygothrica em um mesmo clado dentro do
gênero Drosophila. Quanto a Cladochaetini, sua análise indicaria parentesco mais próximo a
Ephidridae que aos Drosophilidae. Essas conclusões estão baseadas em poucos caracteres e
parecem indicar fragilidade dos resultados obtidos.

Coleta de exemplares
Serão realizadas coletas de drosofilídeos adultos e juvenis periodicamente durante o período de 12 meses. Essas coletas serão realizadas prioritariamente em seis localidades na Região Sul do Estado do Rio Grande do Sul, mas também eventualmente em outras localidades brasileiras. As áreas no Rio Grande do Sul são 1) Horto Botânico Irmão Teodoro Luís (Município de Capão do Leão); 2) Barragem do Rio Chasqueiro (Município de Arroio Grande); 3) Reserva Biológica do Mato Grande (Município de Arroio Grande); 4) Estação Ecológica do Taim (Município de Santa Vitória do Palmar); 5) Arroio Pelotas (município de Pelotas); 6) Rio Piratini (Município de Pelotas). Além disso, temos acesso a material já coletado nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Pará, Mato Grosso do Sul e São Paulo e no Distrito Federal.
Para as coletas de Drosophilidae, três metodologias serão empregadas:
a) Armadilhas do tipo Malaise, empregadas para interceptar os insetos adultos durante o voo. É uma armadilha pouco seletiva, mas eficaz para a amostragem de uma grande diversidade de espécies;
b) Coleta de imaturos associados a corpos de frutificação de fungos macroscópicos e flores e frutos de plantas em decomposição. Será realizada uma varredura visual na localidade de coleta em busca de cogumelos, que serão fotografados para determinação por especialista, recolhidos com auxílio de um canivete e acondicionados em embalagem de papel ou plástica para transporte até o laboratório. Em laboratório eles serão pesados e mantidos em frascos com areia autoclavada por 30 dias para avaliar a fauna emergente. Este método de coleta permite que sejam identificados os sítios de oviposição das espécies amostradas, que serão utilizados como caracteres para as análises filogenéticas;
c) Complementarmente, serão utilizadas armadilhas de retenção de garrafa PET ou Van-Someren com iscas de banana fermentada para amostrar espécies de Drosophilidae frugívoros/detritívoros para utilização nas abordagens comparativas.
Todos os exemplares serão mantidos em álcool absoluto e, no caso dos exemplares utilizados nas descrições de novas espécies, serão secos com protocolo utilizando hexametildisilisano (HMDS) (Brown 1993).

Revisão de exemplares depositados em museus
Será feito contato com os responsáveis por coleções científicas brasileiras e no exterior para estudo das espécies de Hirtodrosophila, Paraliodrosophila, Mycodrosophila, Paramycodrosophila, Zygothrica para consulta do material depositado. Essas instituições incluem: (1) Coleção Entomológica do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil (CEIOC); (2) Museu Nacional do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil (MNRJ); (3) Museu de Zoologia de São Paulo, São Paulo, Brasil (MZUSP); (4) American Museum of Natural History, Nova Iorque, Nova Iorque, E.U.A. (AMNH); (5) National Museum of Natural History, Washington, D.C., E.U.A. (USNM); (6) Natural History Museum, Londres, Reino Unido (BMNH); (7) Zoologische Museum, Humboldt Universitat, Berlim, Alemanha (ZMHU); (8) National Museum, Bloemfontein, África do Sul (BMSA).

Identificação taxonômica
Para a determinação das espécies será analisada a morfologia externa do corpo e a terminalia masculina ou feminina dos indivíduos. Tal procedimento é necessário em função da grande quantidade de espécies crípticas ou de difícil reconhecimento. Antes do estudo da terminalia, os indivíduos terão a região posterior de seu abdômen removido, sendo clarificados segundo a metodologia proposta por Bächli et al. (2004), com algumas modificações, para então serem dissecados.
Os táxons de fungos e plantas coletados serão identificados por especialistas colaboradores. Fotografias (e amostras, quando necessário) dos corpos de frutificação dos fungos coletados serão encaminhadas para o Prof. Dr. Eduardo Bernardi, do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas. Já, as exsicatas e fotografias das plantas coletadas serão encaminhadas para professores do Departamento de Botânica desta mesma instituição.

DNA Barcode
Para a abordagem do DNA Barcode, o DNA dos indivíduos será extraído individualmente de moscas inteiras com o uso do kit NucleoSpin Tissue XS (MACHEREY-NAGEL). No caso da extração de exemplares pertencentes às espécies raras ou depositados em coleções científicas, a extração ocorrerá no processo de clarificação da terminalia, onde a região posterior do abdômen será banhada em uma solução de proteinase em condições controladas antes de ser colocada nas substâncias clareadoras, ou mesmo substituindo as mesmas. Após o fragmento de abdômen será retirado da solução e será conduzida a extração de DNA por protocolo de Abrão et al. (2005).
Posteriormente, a amplificação por PCR dar-se-á com o uso dos seguintes pares de primers de Simon et al. (1994) os genes mitocondriais citocromo oxidase c subunidade I (coI) e citocromo oxidase c subunidade II (coII). Os amplicons assim obtidos serão purificados e diretamente sequenciados. O sequenciamento será realizado por empresa terceirizada.
A montagem dos eletroferogramas será realizada com o uso do pacote Staden (Staden 1996). As sequências consenso assim obtidas terão sua identidade confirmada pelo uso do BLASTN (NCBI site), sendo então, alinhadas entre si no programa ClustalX 2 (Larkin et al. 2007).
Para detecção do Barcode GAP, serão mensuradas as distâncias intra e interespecífica pelo modelo Kimura dois parâmetros (K2P) (Kimura 1980). Também será utilizada uma abordagem filogenética para a delimitação das espécies com a aplicação dos métodos de Máxima Verossimilhança, executado no PAUP 4.0b10, e Análise Bayesiana, realizada no programa MrBayes 3.2.6 (Ronquist et al. 2011), ambas segundo o modelo indicado pelo jModelTest2 (Darriba et al. 2012). A confiabilidade na primeira análise será medida pela utilização do teste de bootstrap (Felsenstein 1985), enquanto na Análise Bayesiana a probabilidade posterior de cada um dos agrupamentos será avaliada.

Descrição de novas espécies
Após a delimitação das espécies pela abordagem das técnicas de DNA Barcode e concomitante análise da morfologia para verificação de caracteres morfológicos que possam ser utilizados na diagnose das espécies evidenciadas pelo primeiro método, as espécies serão descritas conforme Bächli et al. (2004) e Cumming & Wood (2017). Serão confeccionadas pranchas com fotografias da morfologia externa e ilustrações e fotomicrografias das terminalias masculina e/ou feminina.

Análises filogenéticas
Atualmente, há exemplares de cerca de 100 espécies descritas de Hirtodrosophila, Paraliodrosophila, Mycodrosophila, Paramycodrosophila, Zygothrica coletadas ou emprestadas disponíveis para a execução do projeto. Ainda, outras 15 espécies estão em fase de descrição. Tais espécies, e outras obtidas posteriormente, comporão o grupo interno de nossas análises filogenéticas. Como grupos-externos, utilizaremos espécies de outros gêneros de Drosophilini, Steganinae, Curtonotidae e Ephydridae. Essa abordagem é necessária dada a incerteza quanto à monofilia do próprio grupo de gêneros Zygothrica. O uso de clados em diversos níveis dentro e fora de Drosophilini e o uso de um grande número de espécies nos grupos externos permite um enraizamento seguro da árvore.
Para as análises filogenéticas, serão obtidas sequências dos genes nucleares alfa-metildopa (amd) e dopa descarboxilase (ddc), além das sequências dos genes mitocondriais mencionados anteriormente, coI e coII. Os primers que serão utilizados na amplificação das sequências nucleares foram descritos por Robe et al. (2010) e Tatarenkov et al. (1999), respectivamente. O procedimento laboratorial para a extração do DNA, amplificação das sequências, sequenciamento e montagem dos eletroferogramas serão os mesmos que os apresentados anteriormente. Cabe salientar que muitas das espécies alvo desta proposta já possuem sequências dos genes mitocôndrias estabelecidas e que serão utilizadas neste estudos (Machado et al. 2017) Além disso, sequências dos marcadores moleculares serão pesquisadas no GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), complementando as sequências obtidas por nós.
As sequências serão montadas com o software Gap4 pacote Staden (Staden 1996), alinhadas com o algoritmo ClustalW no software Mega 6 (Tamura et al. 2013). Os parâmetros descritivos das matrizes serão obtidos pelo software Mega 6 e a saturação dos dados pelo software DAMBE 5 (Xia 2013). Os métodos utilizados para as análises filogenéticas serão Neighbor Joining e Máxima Parcimônia, realizadas no software PAUP 4.0a147 (Swofford 2003); Máxima Verossimilhança, executada no software PhyML 3.1 (Guindon & Gascuel 2003); Análise Bayesiana, conduzida no software MrBayes 3.2.6 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). A confiabilidade das três primeiras análises será medida pelo teste de bootstrap (Felsenstein 1985) e da última pela probabilidade posterior de cada agrupamento. Árvores de evidências totais serão avaliadas pelo suporte particionado de Bremer (Bremer 1988, 1994) e/ou de verossimilhança (Lee & Hugall 2003) com o software TreeRot 3.0 (Sorenson & Franzosa 2007).
A congruência entre as diferentes partições será medida pelo teste de homogeneidade no software PAUP 4.0b10. A probabilidade posterior de que diferentes partições compartilhem a mesma árvore será avaliada pela análise de concordância Bayesiana (Ané et al. 2007) no software Bucky 1.2 (Larget et al. 2010). Topologias alternativas obtidas mediante o uso de diferentes métodos para uma mesma partição, ou mediante o uso de diferentes partições, serão comparadas sob diferentes matrizes pelos testes de Templeton (Templeton 1983) e Shimodaira-Hasegawa (Shimodaira & Hasegawa 1999).

Este projeto é continuação de projeto iniciado em 01/08/2019, e vem sendo desenvolvido ao longo destes anos no Laboratório de Evolução e Genética de Insetos. Os 12 meses restantes de atividades previstos na presente proposta resultarão na finalização das atividades previstas neste grande projeto, finalizando um ciclo de atividades e orientações, culminando na organização sistemática de dezenas de espécies, com sua inclusão em novas hipóteses filogenéticas e caracterização taxonômica das mesmas. Tais informações potencializam a futura utilização destas espécies em estudos ecológicos, morfológicos e fisiológicos.