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Considerando que as alternativas antineoplásicas disponíveis no arsenal terapêutico apresentam severos efeitos adversos e a medicina popular descreve Jodina rhombifolia hook et Arn com propriedades antitumorais, este estudo se justifica pela busca de novas alternativas mais eficazes e de menor custo em uma espécie encontrada em nossa região.

Preparo do Extrato Vegetal Folhas de Jodina rhombifolia hook et Arn serão coletadas entre os meses de outubro a fevereiro em Pelotas e municípios da região Sul. As folhas após secagem serão trituradas. O preparo do extrato aquoso será realizado por decocção a temperatura de 70°C por 3 horas. Ao final será realizada filtração e o filtrado mantido sob refrigeração enquanto que ao resíduo será novamente adicionado água e repetido por três vezes. Após o volume total do extrato será congelado a -83°C para posterior liofilização. O extrato metanólico será obtido por maceração dinâmica a 40°C por 24 horas. Após esse período o extrato será decantado e filtrado. Enquanto o filtrado será mantido sob refrigeração, o resíduo será submetido a nova extração por mais 24 horas. E assim totalizando 72 horas de extração. Após esse período o volume total de extrato metanólico será reunido e concentrado em aparelho evaporador rotatório. Posteriormente o extrato obtido será diluído em água e serão realizadas sub-extrações com os solventes orgânicos: diclorometano, acetato de etila e n- butanol. Cultura Celular As células da linhagem do câncer de próstata (PC-3, DU145 e LNCaP) serão mantidas em meio de cultura (RPMI) (Sigma), suplementado com 10% soro fetal bovino (SFB) (Cultilab) e 1% de solução antibiotica-antimicotica (Sigma). As células serão semeadas em placas de 24 poços e após atingirem a confluência, serão tratadas com frações de extratos do Jodina rhombifolia diluídas em diclorometano, acetato de etila e n- butanol nas concentrações 1nM 10nM 100nM 1M 10M. As células serão mantidas em estufa umidificada a 37°C com atmosfera de 5% de CO2 por 7 dias. Durante esse tempo, metade do meio de cultivo celular será trocado por meio fresco a cada 24h. Em seguida, os sobrenadantes das culturas serão coletados, aliquotados e estocados em freezer a -80°C até o momento das análises (Holandino e et al., 2001; Gross et al., 1994;2005). Contagem de Células: O número de células será determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco, Germany) e a suspensão celular ajustada a concentração de 5x106 células para realização dos testes propostos. Viabilidade celular O ensaio com de brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) é um ensaio colorimétrico que reflete a viabilidade celular. Vinte e quatro horas após o início do tratamento das células com as frações de extratos do Jodina rhombifolia, o meio de cultura será removido e as células incubadas com MTT em solução salina tampão fosfato (PBS). As células serão incubadas durante 3h, a 37°C, com MTT 0,75 mg/ml. (Mosmann, 1983). A absorbância será determinada a um comprimento de onda de 570 nm, usando como referência o comprimento de onda de 620 nm, num leitor automático de placas de ELISA (UEA). A viabilidade celular será expressa em percentagem relativa a absorbância determinada nas células controle (Liu et al., 1996). Analises Morfológicas O aspecto morfológico das células será monitorado durante todo experimento em microscópio de luz invertido e microscópio de contraste de fase e comparado com dados obtidos ao longo dos experimentos a cada 24h após a confluência das células em cultivo. Análise e quantificação de proteínas que regulam a proliferação celular, através da técnica de Western blott onde as células serão homogeneizadas e centrifugadas. As proteínas serão dosadas e a concentração das amostras a ser aplicada no gel será determinada. As proteínas serão então separadas por eletroforese SDS-PAGE e a seguir serão transferidas para uma membrana de PVDF. As membranas serão bloqueadas a temperatura ambiente por 1h em tampão TBS contendo 3% leite desnatado e 0,05% tween-20 e incubadas overnight a 4°C com o anticorpo primário adequados para mTOR. Após a incubação as membranas serão lavadas com TBS e incubadas a temperatura ambiente com o anticorpo secundário adequado ao anticorpo primário utilizado anteriormente, por 120 min. Para visualização das bandas será usado o kit Western Breeze, Invitrogen, as membranas serão escaneadas e será efetuada uma análise de imagens para quantificar a intensidade das mesmas.

Este é um estudo que busca solidificar uma linha de pesquisa interdisciplinar abordando aspectos morfológicos, moleculares e bioquímicos dos efeitos das frações de extratos de Jodina rhombifolia sobre as linhagens tumorais de próstata PC3, DU145 e LNCaP. Espera-se, que ao concluir esse estudo obter melhor entendimento acerca da atividade desses extratos sobre cultivos celulares tumorais. Os resultados serão apresentados nos Salões de Iniciação Científica e eventos nacionais e Internacionais. Além disso, prevemos publicação em periódico internacional e os possíveis desdobramentos em nível de Mestrado e Doutorado, promovendo assim uma consolidação desta linha de pesquisa.