Nome do Projeto
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE FRAÇÕES DE EXTRATOS DE Jodina rhombifolia EM LINHAGEM DE CÉLULAS TUMORAIS: PC3, DU145 e LNCaP.
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
17/11/2022 - 31/12/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O câncer de próstata é notadamente reconhecido como um problema de saúde pública, dado a sua magnitude no quadro de morbimortalidade masculina, já possuindo consenso entre órgãos oficiais sobre o seu controle e a sua prevenção (Gomes, 2008). Os produtos naturais têm sido uma importante fonte de novos agentes antineoplásicos. Existem, no mínimo, 250.000 espécies de plantas no mundo, sendo que mais de 1.000 plantas apresentam propriedades antitumorais significantes (Freshney, 2005). Justificando o aumento da busca em todo o mundo de novas terapias, mais eficientes, oriundas de fitoterápicos. Tendo em vista que a maioria dos tratamentos atualmente disponíveis, como radioterapia e quimioterapia, utilizadas como primeira escolha para o tratamento do câncer, apresentam sérios efeitos adversos como inibição da resposta imunológica e a mielossupressão, visto que não apresentam toxicidade seletiva, é necessário buscar novas drogas com efeitos mais específicos e menor toxicidade (Mukherjee, 2001). A planta Jodina rhombifolia Hook et Arn, é encontrada no sul do Brasil, nos estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Também é nativa da Argentina, Uruguai, Paraguai e Bolívia. Essa planta apresenta atividades terapêuticas descritas na medicina popular como ramos e folhas usados em resfriados, cascas em desinterias e decocção das folhas para curar pólipos nasais e câncer, pó das folhas secas utilizadas para cicatrização. Estudos utilizando extratos obtidos a partir das folhas da planta serão testados in vitro em linhagens tumorais de próstata.

Objetivo Geral

O presente estudo tem por objetivo avaliar os efeitos de frações de extratos do Jodina rhombifolia sobre cultivos de linhagens tumorais PC3, DU145 e LNCaP de próstata.

Justificativa

Considerando que as alternativas antineoplásicas disponíveis no arsenal terapêutico apresentam severos efeitos adversos e a medicina popular descreve Jodina rhombifolia hook et Arn com propriedades antitumorais, este estudo se justifica pela busca de novas alternativas mais eficazes e de menor custo em uma espécie encontrada em nossa região.

Metodologia

Preparo do Extrato Vegetal Folhas de Jodina rhombifolia hook et Arn serão coletadas entre os meses de outubro a fevereiro em Pelotas e municípios da região Sul. As folhas após secagem serão trituradas. O preparo do extrato aquoso será realizado por decocção a temperatura de 70°C por 3 horas. Ao final será realizada filtração e o filtrado mantido sob refrigeração enquanto que ao resíduo será novamente adicionado água e repetido por três vezes. Após o volume total do extrato será congelado a -83°C para posterior liofilização. O extrato metanólico será obtido por maceração dinâmica a 40°C por 24 horas. Após esse período o extrato será decantado e filtrado. Enquanto o filtrado será mantido sob refrigeração, o resíduo será submetido a nova extração por mais 24 horas. E assim totalizando 72 horas de extração. Após esse período o volume total de extrato metanólico será reunido e concentrado em aparelho evaporador rotatório. Posteriormente o extrato obtido será diluído em água e serão realizadas sub-extrações com os solventes orgânicos: diclorometano, acetato de etila e n- butanol. Cultura Celular As células da linhagem do câncer de próstata (PC-3, DU145 e LNCaP) serão mantidas em meio de cultura (RPMI) (Sigma), suplementado com 10% soro fetal bovino (SFB) (Cultilab) e 1% de solução antibiotica-antimicotica (Sigma). As células serão semeadas em placas de 24 poços e após atingirem a confluência, serão tratadas com frações de extratos do Jodina rhombifolia diluídas em diclorometano, acetato de etila e n- butanol nas concentrações 1nM 10nM 100nM 1M 10M. As células serão mantidas em estufa umidificada a 37°C com atmosfera de 5% de CO2 por 7 dias. Durante esse tempo, metade do meio de cultivo celular será trocado por meio fresco a cada 24h. Em seguida, os sobrenadantes das culturas serão coletados, aliquotados e estocados em freezer a -80°C até o momento das análises (Holandino e et al., 2001; Gross et al., 1994;2005). Contagem de Células: O número de células será determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco, Germany) e a suspensão celular ajustada a concentração de 5x106 células para realização dos testes propostos. Viabilidade celular O ensaio com de brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) é um ensaio colorimétrico que reflete a viabilidade celular. Vinte e quatro horas após o início do tratamento das células com as frações de extratos do Jodina rhombifolia, o meio de cultura será removido e as células incubadas com MTT em solução salina tampão fosfato (PBS). As células serão incubadas durante 3h, a 37°C, com MTT 0,75 mg/ml. (Mosmann, 1983). A absorbância será determinada a um comprimento de onda de 570 nm, usando como referência o comprimento de onda de 620 nm, num leitor automático de placas de ELISA (UEA). A viabilidade celular será expressa em percentagem relativa a absorbância determinada nas células controle (Liu et al., 1996). Analises Morfológicas O aspecto morfológico das células será monitorado durante todo experimento em microscópio de luz invertido e microscópio de contraste de fase e comparado com dados obtidos ao longo dos experimentos a cada 24h após a confluência das células em cultivo. Análise e quantificação de proteínas que regulam a proliferação celular, através da técnica de Western blott onde as células serão homogeneizadas e centrifugadas. As proteínas serão dosadas e a concentração das amostras a ser aplicada no gel será determinada. As proteínas serão então separadas por eletroforese SDS-PAGE e a seguir serão transferidas para uma membrana de PVDF. As membranas serão bloqueadas a temperatura ambiente por 1h em tampão TBS contendo 3% leite desnatado e 0,05% tween-20 e incubadas overnight a 4°C com o anticorpo primário adequados para mTOR. Após a incubação as membranas serão lavadas com TBS e incubadas a temperatura ambiente com o anticorpo secundário adequado ao anticorpo primário utilizado anteriormente, por 120 min. Para visualização das bandas será usado o kit Western Breeze, Invitrogen, as membranas serão escaneadas e será efetuada uma análise de imagens para quantificar a intensidade das mesmas.

Indicadores, Metas e Resultados

Este é um estudo que busca solidificar uma linha de pesquisa interdisciplinar abordando aspectos morfológicos, moleculares e bioquímicos dos efeitos das frações de extratos de Jodina rhombifolia sobre as linhagens tumorais de próstata PC3, DU145 e LNCaP. Espera-se, que ao concluir esse estudo obter melhor entendimento acerca da atividade desses extratos sobre cultivos celulares tumorais. Os resultados serão apresentados nos Salões de Iniciação Científica e eventos nacionais e Internacionais. Além disso, prevemos publicação em periódico internacional e os possíveis desdobramentos em nível de Mestrado e Doutorado, promovendo assim uma consolidação desta linha de pesquisa.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ADRIANA LOURENCO DA SILVA1
CAROLINE CRESPO DA COSTA1
GIOVANA DUZZO GAMARO1
IZABEL CRISTINA CUSTODIO DE SOUZA1
JULIANA OLIVEIRA SCHAUN
LETICIA FIGUEIREDO MOURA
MARIANGELA HEPPE LOPES4
TCHANDRA MACHADO DE VARGAS

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