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As plantas são sensíveis a uma grande variedade de estímulos, como vento, chuva, toque, luz, fotoperíodo, choque térmico, seca, feridas infligidas por herbívoros, ataque de pragas e até radiação eletromagnética. Na maioria das vezes, a resposta final das plantas a esses estímulos é uma modificação do metabolismo, crescimento e / ou morfogênese, que pode influenciar a planta inteira ou apenas localmente (DEMONGEOT et al., 2019). Estudos sugerem que mais de 60% das flutuações de rendimento anual de culturas agrícolas são atribuídas à variabilidade climática (VENTOURIS et al., 2020). Todavia, os efeitos da recorrência de “fatores estressantes” (mesmo fator de estresse atuando em diferentes momentos sequenciais) e/ou co-ocorrência (diferentes fatores de estresse ocorrendo simultaneamente ou sequencialmente) ao longo de todo o ciclo de vida da planta têm sido relativamente pouco estudados e compreendidos, apesar de se tratar do cenário mais próximo enfrentando pelas plantas em condições naturais ou de cultivo.
Recentemente, o estudo dos potenciais impactos desses eventos perturbadores recorrentes revelou o que tem sido associado a um fenômeno de “memória” em plantas (THELLIER; LÜTTGE, 2013; CRISP et al. 2016; GALVIZ et al., 2020). A habilidade de gerar diversas respostas finais a partir de sinais do ambiente evidencia que as plantas parecem se comportar de maneiras adaptativas, flexíveis, antecipatórias e direcionadas a objetivos (TREWAVAS 2003; CALVO et al., 2020).
Levando isso em consideração, Segundo-Ortin e Calvo (2019) argumentam que o comportamento das plantas indica serem elas agentes

cognitivos. Como parte das capacidades cognitivas, memória e aprendizagem são processos pelos quais as plantas podem modificar seu comportamento.
Devido a tensões ambientais recorrentes ao longo de todo o ciclo de vida, as plantas podem exibir respostas diferentes a condições semelhantes ao longo do tempo (AVRAMOVA, 2015); isto é o que se tem caraterizado como um efeito de memória. Baseadas na experiência anterior, as plantas podem aprender (entendendo como aprendizagem uma melhoria da eficiência das futuras respostas das plantas a partir de experiências passadas), pois de forma contraria, quando a planta mantém respostas que são essencialmente as mesmas nenhum aprendizado aconteceria e, algumas vezes, novas situações estressantes poderiam causar danos mais extensos, diminuindo a sobrevivência e/ou o fitness da planta (SOUZA et al., 2018). Então, uma das possíveis respostas das plantas à exposição ao estresse recorrente é uma maior resistência ou tolerância a futuras exposições por meio da aquisição de memória, engendrando respostas conhecidas comumente como endurecimento (hardening), condicionamento (priming) ou aclimatação (CRISP et al., 2016). A melhoria nas respostas futuras causadas pelo priming envolve o armazenamento de informações sobre o estímulo de estresse após a cessação do mesmo (isto é, formação de memória). A duração dessa memória pode estar na faixa de dias a semanas, mas em alguns casos pode se estender à descendência (memória do estresse inter ou transgeracional) (STIEF et al., 2014; LÄMKE; BÄURLE, 2017). Em outras palavras, a memória está na base dos mecanismos que propiciam os fenômenos de aclimatação e hardening induzidos por um estímulo prévio (priming) de mesma natureza ou de natureza diversa dos estímulos subsequentes.
Termos como memória, aprendizagem e comportamento são associados à inteligência e raramente usados para descrever o mundo vegetal, pois é pressuposto que tais habilidades requerem um sistema nervoso (VERTOSICK, 2002). Entretanto, existem modelos bem estabelecidos de aprendizagem e memória, processamento de informação e resposta que não envolvem tecido neuronal, mas sim processos celulares e moleculares, tais como respostas imunes (NETEA et al., 2011; MARIN; KIPNIS, 2013), hereditariedade genética

(HERSEY; CHASE, 1952; CHANDRASEKARAN et al., 2017) e modificações epigenéticas (YUNG; ELSÄSSER, 2017; NAIK et al., 2017).
Assim, não seria sem precedentes assumir que plantas realmente possuam mecanismos celulares e moleculares que permitissem o aprendizado e a memória (MICHMIZOS; HILIOTI, 2019). Mecanismos de memória de estresse podem variar amplamente dependendo do nível organizacional enfocado nos estudos realizados, variando desde alterações na anatomia foliar à epigenômica, incluindo mecanismos fenológicos, bioquímicos e fisiológicos que podem operar de forma integrada para cumprir um papel na memória da tolerância do estresse vegetal (THELLIER; LÜTTGE, 2013; FLETA-SORIANO et al., 2015). Alguns mecanismos moleculares que sustentam a memória das plantas foram elucidados até o momento. Um mecanismo de formação da memória pode ser baseado em alterações sustentadas nos níveis dos principais metabólitos de sinalização ou fatores de transcrição, que fornecem uma explicação de como o metabolismo das plantas é alterado e mantido pela exposição a vários estresses (BRUCE et al., 2007; CONRATH 2011; VRIET et al., 2015). Outra via possível poderia ser alterações nos estados da cromatina, como modificações da cauda de histonas, metilação do DNA ou inativação da RNA polimerase II, que poderiam desempenhar um papel adicional nas alterações coordenadas nos padrões de expressão gênica que sustentam as respostas de memória (AVRAMOVA, 2015).
Estudos conduzidos recentemente com o objetivo de avaliar o papel da regulação epigenética nas respostas ao estresse sugerem que modificações epigenéticas podem servir, por exemplo, na adaptação ao frio, desde respostas imediatas ao estresse, bem como na adaptação a longo prazo (IWASAKI e PASZKOWSKI, 2014). Mudanças nos padrões de metilação do DNA, modificações na cromatina e miRNAs estão entre as modificações mais reportadas em resposta à baixa temperatura (STEWARD et al., 2002; PAN et al., 2011; SONG et al., 2013; LIU et al., 2017; DAI et al., 2015; SUN et al., 2020). Um bem conhecido exemplo da memória ao frio é o processo de vernalização em Arabidopsis, no qual mudanças na expressão e silenciamento do gene FLC é fortemente regulada por modificações na cromatina em

resposta a um período de frio, permitindo o florescimento (IWASAKI e PASZKOWSKI, 2014). Porém, estudos para caracterizar as respostas de memória em outras espécies (ao exemplo de grandes culturas) não estão tão bem descritos. Algumas perguntas permanecem sem resposta, entre elas: em plantas de clima tropical, nas quais o frio pode ser um fator letal, ocorrem as mesmas respostas à nível epigenético? Em plantas cultivadas que possuem maiores genomas em comparação à Arabidopsis, que implicações tem toda essa informação genética adicional? Ao utilizar análises de metilação de DNA em todo o genoma, Shi et al. (2015) observaram diferenças entre Arabidopsis e arroz, bem como um grau de conservação, muito maior de metilação de DNA em arroz, associado com os mais numerosos elementos transponíveis presentes no genoma desta espécie.
Em um recente estudo sobre mecanismos envolvidos na memória ao estresse, do Amaral et al. (2020) verificaram que a memória de longo prazo à salinidade no arroz é suportada por mecanismos epigenéticos. Neste quesito, um ponto a ser respondido é a persistência desta memória na planta. É geralmente aceito que uma memória de curto prazo (provavelmente atrelada ao incremento de metabólitos ou fatores de transcrição) pode persistir por dias ou semanas, e uma memória baseada em mecanismos epigenéticos pode persistir por meses e eventualmente ser transmitida à descendência (CRISP et al., 2016). Tem sido demostrado que a duração e efeito da memória podem estar ligados, entre outras coisas, ao estágio fenológico em que foi aplicado o primeiro estresse. Leuendorf et al. (2020) descobriram que Arabidopsis exibe respostas de memória aprimoradas ao congelamento quando o estímulo é aplicado a mudas de 14 ou 21 dias de idade e não em mudas de 7 dias de idade. Kron et al. (2008) mostraram que plantas de soja que experimentaram déficit hídrico no estágio V4 (vegetativo) desenvolveram um processo de tolerância melhorada à um futuro período de escassez hídrica, ao contrário do que ocorreu quando o primeiro estímulo foi aplicado no estágio R1 (início do reprodutivo) da planta. Portanto, os autores reforçaram a hipótese de que existem diferentes estágios específicos de desenvolvimento em que uma perturbação ambiental pode ser integrada de forma adaptativa e melhorar a capacidade de responder a condições severas subsequentes. Isso coincide com as observações de Pan et al. (2011), os quais relataram que as alterações de metilação do DNA induzidas pelo frio são específicas para os genótipos e dependem do estágio de crescimento e do tipo de tecido / órgão.
Assim, o entendimento dos processos fisiológicos e moleculares que permitem as plantas confrontar mudanças ambientais a partir da experiência prévia é uma alternativa para o melhoramento das culturas, seja por alterações epigenéticas induzidas, seja pelo manejo de primings estimulando aumento de tolerância a futuros eventos de estresse ao longo do ciclo das culturas. Dessa forma, espera-se que os resultados produzidos a partir desse projeto possam contribuir para desvendar novas estratégias de melhoramento e manejo de plantas cultivadas.

A pesquisa compreenderá três experimentos que visam atender aos objetivos específicos propostos. No primeiro experimento será investigada a aquisição de memória epigenética induzida pelo frio recorrente (objetivo específico 1). O segundo experimento será realizado com a finalidade de determinar as alterações bioquímicas que orquestram as respostas de tolerância cruzada induzidas por um choque térmico seguido de déficit hídrico em plantas de arroz subexpressando APX (objetivos específicos 2 e 3). Por fim, no experimento três será explorada a questão sobre a transferência de memória transgeracional (objetivo específico 4).

EXPERIMENTO 1: Aquisição da memória epigenética ao frio em plantas de arroz

Esse estudo em particular será desenvolvido em colaboração com o Dr. Miguel de Lucas, da Universidade de Durham (UK), dentro da proposta de PDSE de minha aluna de doutorado Yutcelia Carolina Galviz Fajardo.
Sementes de arroz (Oryza sativa L. Japonica cv. Nipponbare) serão obtidas no Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), esterilizadas em hipoclorito de sódio 4% por 30 min e germinadas em bandejas com areia em um Câmara de crescimento tipo BOD (Modelo 202, EletroLab, São Paulo, Brasil), com fotoperíodo de 12 h de luz e 12 h de escuridão à temperatura de 25 ° C, onde permanecerão por 10 dias. Após este período, as plântulas serão transferidas para vasos plásticos de 1,8 L utilizando como substrato areia previamente lavada com água, autoclavada e seca em estufa. As plantas serão mantidas em câmara de crescimento com ambiente controlado a 80% de umidade relativa, temperatura de 30º C dia / 24º C noite e fotoperíodo de 10 h de luz. A irrigação será efetuada a cada dois dias com uma solução nutritiva Hoagland e Arnon (1950).
Ao atingirem os estágios V4, V6 ou V8, de acordo à escala Counce et al. (2000), as plantas serão expostas a condições de choque frio. Para isso, as plantas serão divididas em grupos 4 grupos: 1-controle; as plantas permanecerão nas condições de crescimento - temperatura, fotoperíodo e umidade - descritas anteriormente enquanto para os seguintes tratamentos as plantas serão submetidas por 72h a temperaturas de 15º C dia / 12º C noite nos estágios V4 (Tratamento 2), V6 (Tratamento 3) e; V8 (Tratamento 4). Logo após este período as plantas serão novamente submetidas as condições normais de crescimento (as mesmas do controle) até atingirem o estágio R2, ou seja, antes da emergência da panícula, quando serão divididas novamente em grupos e um novo estímulo de frio (segundo evento de choque) será aplicado durante 72h (15º C dia / 12º C à noite). Portanto, as condições finais serão as seguintes: (I) controle (C): as plantas receberão temperaturas normais

ao longo do experimento; (II) reprodutiva (CR): plantas expostas ao choque frio apenas na fase reprodutiva; (III) vegetativo 4+ reprodutivo (CV4 + R): plantas expostas ao choque pelo frio no estágio vegetativo 4 e reprodutivo; (IV) vegetativo 6 + reprodutivo (CV6 + R): plantas expostas ao choque de frio no estágio vegetativo 6 e reprodutivo; e (V) vegetativo 8 + reprodutivo (CV8 + R): as plantas que serão expostas ao choque pelo frio na fase vegetativa 8 e reprodutiva.

EXPERIMENTO 2: Alterações bioquímicas nas respostas de tolerância cruzada induzidas por um choque térmico seguido de déficit hídrico em plantas de arroz subexpressando APX

O material a ser utilizado será plantas de arroz (Oryza sativa L. spp. Japonica cv. Nipponbare) não transformadas (NT), e mutantes que subexpressam isoenzimas APX: alguns mutados na APX 7 (OsAPX7) e outros nas APX 8 (OsAPX8). As sementes de arroz serão fornecidas pelo Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

4.2.1. Condições de estudo e tratamentos

Sementes serão esterilizadas em hipoclorito de sódio a 1,5% (m/v) por 20 min, sob agitação eventual, lavadas três vezes e embebidas overnight em água destilada. Posteriormente, estas sementes serão distribuídas em papel para germinação (280 x 380 mm) e umedecidas com água destilada na proporção de duas vezes a massa do papel e levadas em câmera de germinação a uma temperatura de 25ºC. Aos 10 dias após semeadura, as plântulas serão



transplantadas a vasos plásticos contendo areia e irrigadas com solução nutritiva Hoagland e Arnon. As plantas serão mantidas em câmera de crescimento com temperatura 30ºC/dia e 24ºC/noite e fotoperíodo de 10h de luz e 70% de umidade relativa.
O tratamento de choque térmico (alta temperatura = 40ºC) por 2 horas será aplicado quando as plantas atingirem o estágio V8. Um terço das plantas receberão o choque térmico seguido de seca, outro terço apenas serão submetidos a seca e plantas que nunca receberão estímulo nenhum serão usadas como grupo controle. O experimento estará arranjado em um esquema fatorial 3x2 (3 materiais genéticos: NT, APX7e APX8 x 3 tratamentos de alta temperatura: sem estresse, apenas déficit hídrico e choque térmico + déficit hídrico).

EXPERIMENTO 3: Efeito de memória transgeracional

Este experimento será desenvolvido com a finalidade de avaliar como a memória positiva (aprendizagem) produto da aplicação de eventos de alta temperatura recorrentes nas plantas da geração parental influi na germinação e dormência de sementes de arroz, assim como no desempenho das futuras plântulas sob déficit hídrico.

Impactos esperados

Estímulos ambientais são capazes de deixar “marcas” no DNA sem alterar a sua sequência, mas são capazes de afetar a atividade transcricional da cromatina através de modificações covalentes no DNA e nas histonas, as quais podem ser propagadas mitótica ou meióticamente (IWASAKI e PASZKOWSKI, 2014). Conhecido como epigenética, este campo de estudo pode auxiliar na compreensão da memória ao estresse e ao mesmo tempo elucidar a maneira como é direcionada a expressão de características de importância agronômica em resposta às mudanças no ambiente (VENTOURIS et al., 2020). Lämke e Bäurle (2017) sugerem que uma maneira possível, mas amplamente inexplorada, de melhorar a tolerância ao estresse pode ser aumentar a memória de estresse por meio da ativação de respostas de priming ou da modificação direcionada do epigenoma.
Arabidopsis thaliana é a planta modelo de muitos estudos epigenéticos, porém existe a necessidade de ampliar e constatar se os mecanismos nela estudados são representativos das plantas cultivadas com fins agronômicos. Assim o estudo em arroz (Oryza sativa L.) como planta modelo para monocotiledóneas constitui uma alternativa mais próxima quando se quer conhecer efeitos do estresse sobre produção e rendimento das culturas (SHI et al., 2015). O arroz, à sua vez, é uma das culturas de cereais mais importantes, fornecendo alimentos para mais da metade da população mundial (ZHANG et al., 2017). O. sativa é cultivada em regiões tropicais, subtropicais ou temperadas, sendo que no Brasil o estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor de arroz irrigado com uma produção anual de 7.840.478 toneladas (IRGA, 2020).
A ocorrência frequente de perdas de produção em virtude de eventos climáticos levou à busca por genótipos que demostrem tolerância à estresses ambientais. Em conjunto às técnicas de edição genômica, a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na organização e remodelação da



cromatina tem potencial para o desenvolvimento de estratégias de melhoramento inovadoras (PECINKA et al., 2020). Porém, a aplicabilidade das
modificações da cromatina para fins de melhoramento depende de sua estabilidade e herdabilidade, isto implica serem mantidas por meio de mitose e, idealmente, por meiose. No entanto, para culturas propagadas por sementes, modificações específicas da cromatina precisam passar pelas barreiras de redefinição epigenética durante a gametogênese e o desenvolvimento da semente, a fim de passar para a próxima geração. Sem embargo, estes mecanismos ainda são poucos estudados e controversos.
Assim, o entendimento dos processos fisiológicos e moleculares que permitem as plantas confrontar mudanças ambientais a partir da experiência prévia é uma alternativa para o melhoramento das culturas, seja por alterações epigenéticas induzidas, seja pelo manejo de primings estimulando aumento de tolerância a futuros eventos de estresse ao longo do ciclo das culturas. Dessa forma, espera-se que os resultados produzidos a partir desse projeto possam contribuir para desvendar novas estratégias de melhoramento e manejo da cultura do arroz.