Nome do Projeto
COMPARAÇÃO DA ADMINISTRAÇÃO AD LIBITUM DE DIETAS “VERY LOW FAT” E CETOGÊNICA EM CAMUNDONGOS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/03/2023 - 30/11/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
A pandemia da obesidade representa uma ameaça significativa à saúde pública porque aumenta o risco de desenvolver doenças crônicas não transmissíveis ocasionando efeitos negativos na qualidade de vida, produtividade no trabalho e gerando custos de saúde. A obesidade é uma doença multifatorial que resulta do balanço energético positivo crônico, ou seja, ingestão de energia maior que o gasto energético. Neste contexto, uma das explicações sobre o aumento da prevalência da obesidade é a disponibilidade e o consumo de alimentos altamente variados, saborosos e gordurosos, os quais geram o chamado vício em comer. Enquanto a orientação geral para a alimentação saudável preconiza uma dieta balanceada com relação aos macronutrientes, tanto dietas com baixo teor de gorduras como dietas com baixo teor de carboidratos foram preconizadas como ferramentas para controle de massa corpórea e emagrecimento por muitos grupos com resultados variados. A história do aparecimento desses alimentos industrializados contendo alto nível de palatabilidade e alta quantidade de açúcares, em especial frutose e sacarose é precedida da recomendação de redução da quantidade de gordura nas dietas pelas organizações governamentais, a fim de reduzir a incidência de doenças cardíacas, mas tendo como consequência a redução da palatabilidade das dietas. A indústria alimentícia reagiu rapidamente à propaganda criminalizando produtos com alta quantidade de gorduras, apresentando produtos com baixíssima quantidade de lipídeos, apresentando-os como produtos saudáveis. No entanto, para compensar a redução da palatabilidade dos produtos foram adicionados açúcares, inclusive produtos artificiais como o xarope de milho com alta concentração de frutose. Este fenômeno industrial foi seguido do rápido aumento da prevalência de obesidade nos países que seguiram este comportamento nutricional, aumentando inclusive a incidência das doenças cardíacas, entre outros problemas de saúde relacionados à obesidade. Este projeto visa estudar a administração ad libitum de dietas em camundongos e verificar seus efeitos na composição corporal. Serão utilizados camundongos C57BL6 que receberão diferentes rações todas ad libitum sendo divididos em: grupo controle, grupo cetogênico, grupo low fat com alta quantidade de carboidratos, grupo low fat com carboidratos e sacarose, grupo low fat com carboidratos e glicose e os respectivos grupos intermitentes, onde as dietas restritivas serão administradas por períodos de um mês intercalados com a dieta controle. Serão acompanhadas as alterações na massa corpórea, na glicemia e no comportamento dos animais com testes validados na literatura. No final dos experimentos, serão coletados órgãos e tecidos para análises de alterações no fígado, tecido adiposo e sistema nervoso central, através do estudo bioquímico do sangue, histopatológico clássico, de expressão genética por real time PCR, de sinalização de vias de regulação relacionadas ao apetite e a resistência aos hormônios reguladores por testes glicêmicos e imunoflorescência. Sendo assim, o estudo dessas dietas irá elucidar o efeito no metabolismo dos camundongos e assim poderão surgir novas estratégias de intervenção dietética para prevenção, tratamento da obesidade e diminuição das taxas de morbimortalidade.
Objetivo Geral
Comparar o impacto de dietas administradas ad libitum em camundongos.
Justificativa
A obesidade tem aumentado nas ultimas 5 décadas no pais e em outros paises no mundo, se tornando um grande problema para a saúde pública. Por meio dos resultados atingidos neste estudo, espera-se entender o desempenho das dietas ad libitum em relação aos parâmetros bioquímicos, imunohistoquímicos, morfológicos e comportamentais na obesidade. Espera-se também compreender a atuação destas dietas no metabolismo energético quanto ao consumo e perda de peso e assim dependendo dos resultados poderá ser descoberta uma nova ferramenta dietética para prevenção e tratamento da obesidade.
Metodologia
5. Metodologia
O projeto será submetido para avaliação na Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas. Os procedimentos serão realizados de acordo com a Lei Federal 11.794 de 08 de outubro de 2008, que regulamenta a utilização de animais na pesquisa científica. Os cuidados e manipulação dos animais seguirão as Diretrizes para o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA – Resolução Normativa 30, 2016, CONCEA). A eutanásia seguirá as Diretrizes para a Prática de Eutanásia do CONCEA (Resolução Normativa nº 13, de 20 de setembro de 2013).
5.1 Animais
Serão utilizados camundongos C57BL6. Os animais serão mantidos no biotério do laboratório de nutrição experimental da faculdade de Nutrição, devidamente credenciado junto ao CONCEA, em estantes ventiladas com umidade e temperatura controladas. Os animais serão mantidos em um alojamento específico para a espécie, com temperatura controlada (22 ± 2°C), umidade relativa do ar de 40-60%, ciclo de luz de 12h claro/12h escuro, sistema de exaustão de ar, em caixas de moradia com no máximo cinco animais, e livre acesso à alimentação (ração padrão ou dietas experimentais) e água.
5.2 Desenho experimental
Serão formados por camundongos machos e fêmeas com 03 meses de idade que receberão diferentes rações todas ad libitum sendo divididos da seguinte forma:
Grupo controle (Ctr) receberá ração padrão;
Grupo dieta cetogênica (DK) receberá uma dieta rica em gordura e baixo teor de carboidratos;
Grupo low fat (LF) receberá dieta com baixo teor de lipídeos e alta quantidade de carboidratos, mas sem adição de sacarose e glicose na composição;
Grupo low fat com sacarose (LFS) receberá dieta rica em carboidratos e sacarose, e pobre em gorduras;
Grupo low fat com glicose (LFG) receberá dieta rica em carboidratos e glicose, e pobre em gorduras;
Os grupos intermitentes cetogênico (DK-i), intermitente low fat (LF-i), intermitente low fat sacarose (LFS-i) e intermitente low fat glicose (LFG-i) receberão suas respectivas dietas intercaladas com ração balanceada em períodos de um mês.
Todos os 09 grupos serão compostos com animais machos e fêmeas.
As dietas terão duração de 06 meses sendo que no final deste período serão feitos os testes comportamentais, seguidos pelos testes glicêmicos e coleta de tecidos.
5.3 Dietas Experimentais
5.3.1 Dieta padrão
Será utilizada uma ração comercial para roedores (Presence) com composição seguinte: proteína bruta 23%, lipídios 4,0% e carboidratos 50%, com uma densidade calórica aproximada de 3,8 kcal/100g, administrada ad libitum.
5.3.2 Dieta com muita baixa quantidade de lipídios e alta quantidade de carboidratos
Os animais dos grupos low fat receberão alimentos que tenham muito pouca quantidade de lipídios (máximo 1% em gramas do alimento, visto que o padrão para roedores é 4%), grande quantidade de carboidratos acima de 65% das calorias totais (MOREIRA et al., 2012) e pobre em fibras.
O grupo low fat receberá ração feita com os seguintes ingredientes: tapioca, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento químico (Tabela 1). Está ração possui 81,25% de carboidratos, 15,26% de proteínas e 3,49% de lipídeos das calorias totais. Densidade calórica= 2,57 kcal/100g.
O grupo low fat com sacarose receberá dieta rica em carboidratos e sacarose e pobre em gorduras. A ração será feita com os seguintes ingredientes: tapioca, sacarose, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento químico (Tabela 2). Está ração será composta por carboidratos 84,10%, proteínas 12,95% e lipídios 2,94% do total de energia. Densidade calórica= 3,05 kcal/100g.
O grupo low fat com glicose receberá dieta rica em carboidratos e glicose e pobre em gorduras. A ração será feita com os seguintes ingredientes: tapioca, glicose, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento (Tabela 3). Está ração será composta por 83,75% de carboidratos, proteínas 13,22% e lipídios 3,03% das calorias totais. Densidade calórica= 2,97 kcal/100g.
5.3.3 Dieta com alta quantidade de lipídios e muito baixa quantidade de carboidratos (cetogênica)
Os animais do grupo da dieta cetogênica receberão alimentos que possuam grande quantidade de lipídios, ou seja, mais do que 50% das calorias totais provenientes das gorduras (WEBER et al., 2019). A dieta cetogênica permite um consumo muito baixo de carboidratos (em torno de 5% a 10% da ingestão calórica total ou abaixo de 50g por dia) como meio de aumentar a produção de cetonas (PAOLI et al., 2019).
A ração será feita com os seguintes ingredientes: albumina, banha, óleo de canola e farelo de trigo (Tabela 3). Está ração será composta por 7,27% de carboidratos, 12,44% de proteínas e 80,28% de lipídios provenientes do total de calorias. Densidade calórica= 6,26 kcal/100g.
5.4 Consumo alimentar e ingestão de líquidos totais
O consumo alimentar e de líquidos totais será avaliado diariamente na caixa de moradia, colocando-se uma quantidade conhecida de alimento e após 24h quantificar as sobras. O resultado será obtido dividindo-se essa quantidade pelo número de camundongos que habitam a caixa, expressos pela média de consumo por animal.
5.5. Peso e Composição Corporal
O monitoramento do peso dos animais será realizado semanalmente, em balança digital, os animais serão pesados individualmente e os valores de peso serão registrados em planilhas específicas. A partir dos dados de peso obtido será calculado o ganho de peso dos animais semanalmente e no final do experimento.
5.6. Testes glicêmicos
No final do período de tratamento serão realizados os testes glicêmicos sendo estes: Teste de tolerância à glicose (TTG) e Teste de tolerância à insulina (ITT). Para o TTG será aplicada uma solução de glicose (2 g/kg p.v. i.p.), após 6 horas de jejum, e a glicemia medida nos tempos -15, 0, 15, 30 e 60 minutos relativos ao momento da aplicação. Para o ITT os animais receberão uma injeção de insulina regular Novolin® R, Novo Nordisk®, Montes Claros, Minas Gerais, (0,5 UI/kg p.v. i.p.), após 2 horas de jejum, e a glicemia será medida nos tempos -15, 0, 5, 20 e 35 minutos relativos ao momento da aplicação. Os testes terão um intervalo de 03 dias entre eles para o controle do estresse.
5.7. Análises de secreção de insulina in vivo
A secreção de insulina in vivo será analisada em animais anestesiados com pentobarbital intraperitoneal (25mg/kg PV, volume final entre 200 e 300 mcrL dependendo do peso do animal), e submetidos a uma injeção de glicose (1g/kg PV, em solução a 10%, volume final entre 200 e 300 mcrL dependendo do peso do animal) intraperitoneal. Amostras de sangue (100 mcrL) serão coletados dos animais anestesiados através de punção retrorbital nos tempos 0, 3, 10, 20, e 30 minutos após a injeção. A insulina sérica será medida através de ELISA. Para isso será necessário apenas 10 mcrL de plasma para cada análise, considerando a necessidade do teste ser feito em duplicata, 20 mcrL de plasma para cada coleta. Os animais serão eutanasiados após a última coleta.
5.8 Testes de Comportamento
Serão realizados alguns testes a fim de se determinar alterações comportamentais entre os grupos. Durante os primeiros e últimos dias do tratamento, os animais serão filmados na primeira hora depois do início do acesso para verificar o tempo e a frequência dos animais junto ao recipiente de solução adocicada. Outra análise será o Teste do Intruso/Residente onde os animais serão pesados e transferidos para gaiolas individuais. Após dois dias, um intruso, do mesmo grupo e peso, será introduzido na gaiola por 10 min e o comportamento do residente será filmado. A latência para o primeiro ataque, o número de ataques e a duração dos ataques serão analisados.
5.9 Coleta de Tecidos
O método de eutanásia será exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano. A confirmação da morte se dará pela verificação dos seguintes sinais: ausência de movimento respiratório, ausência de batimentos cardíacos, ausência de pulsação, mucosas pálidas e perda do reflexo corneal. A execução da técnica e a confirmação da morte serão realizadas por um profissional qualificado para esse fim e supervisionadas por um médico veterinário.
O sangue será coletado por punção cardíaca em tubos contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), e mantido em gelo até a centrifugação para separar o plasma das células. As duas frações serão então congeladas e mantidas a -20o C até sua utilização. Tecidos serão coletados, pesados e terão fragmentos congelados em nitrogênio líquido para extração de ácido ribonucleico (RNA) e outro fragmento conservado em solução a 10% de formol tamponado para histologia. Serão coletados tecidos adiposos epididimal, perirenal, lombar intraescapular e marrom. Também serão coletados cérebro, rins, coração, fígado e glândulas adrenais. Os períodos de jejum estão dentro das normas do CONCEA.
5.10 Análises morfológicas
Fragmentos de cérebro, fígado, coração e tecido adiposo conservados em formalina tamponada serão utilizados em análises histológicas que serão feitas por coloração com hematoxilina e eosina por laboratório contratado.
5.11 Análises de expressão gênica
PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) será usado para determinar os níveis de expressão do gene da leptina no fígado, tecido adiposo e músculo esquelético e hipotálamo.
Brevemente: fragmentos de tecido de animais após 08 horas de jejum serão coletados e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. O RNA total das amostras será extraído usando-se um kit de extração e purificação de RNA por colunas. A integridade do RNA será analisada por eletroforese em gel de agarose e a concentração medida por espectrofotometria.
O ácido desoxirribonucleico (DNA) complementar (cDNA) será sintetizado usando kit contendo trancriptase reversa, DNTPs, e iniciadores randômicos de oligonucleotídeos.
O projeto será submetido para avaliação na Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas. Os procedimentos serão realizados de acordo com a Lei Federal 11.794 de 08 de outubro de 2008, que regulamenta a utilização de animais na pesquisa científica. Os cuidados e manipulação dos animais seguirão as Diretrizes para o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA – Resolução Normativa 30, 2016, CONCEA). A eutanásia seguirá as Diretrizes para a Prática de Eutanásia do CONCEA (Resolução Normativa nº 13, de 20 de setembro de 2013).
5.1 Animais
Serão utilizados camundongos C57BL6. Os animais serão mantidos no biotério do laboratório de nutrição experimental da faculdade de Nutrição, devidamente credenciado junto ao CONCEA, em estantes ventiladas com umidade e temperatura controladas. Os animais serão mantidos em um alojamento específico para a espécie, com temperatura controlada (22 ± 2°C), umidade relativa do ar de 40-60%, ciclo de luz de 12h claro/12h escuro, sistema de exaustão de ar, em caixas de moradia com no máximo cinco animais, e livre acesso à alimentação (ração padrão ou dietas experimentais) e água.
5.2 Desenho experimental
Serão formados por camundongos machos e fêmeas com 03 meses de idade que receberão diferentes rações todas ad libitum sendo divididos da seguinte forma:
Grupo controle (Ctr) receberá ração padrão;
Grupo dieta cetogênica (DK) receberá uma dieta rica em gordura e baixo teor de carboidratos;
Grupo low fat (LF) receberá dieta com baixo teor de lipídeos e alta quantidade de carboidratos, mas sem adição de sacarose e glicose na composição;
Grupo low fat com sacarose (LFS) receberá dieta rica em carboidratos e sacarose, e pobre em gorduras;
Grupo low fat com glicose (LFG) receberá dieta rica em carboidratos e glicose, e pobre em gorduras;
Os grupos intermitentes cetogênico (DK-i), intermitente low fat (LF-i), intermitente low fat sacarose (LFS-i) e intermitente low fat glicose (LFG-i) receberão suas respectivas dietas intercaladas com ração balanceada em períodos de um mês.
Todos os 09 grupos serão compostos com animais machos e fêmeas.
As dietas terão duração de 06 meses sendo que no final deste período serão feitos os testes comportamentais, seguidos pelos testes glicêmicos e coleta de tecidos.
5.3 Dietas Experimentais
5.3.1 Dieta padrão
Será utilizada uma ração comercial para roedores (Presence) com composição seguinte: proteína bruta 23%, lipídios 4,0% e carboidratos 50%, com uma densidade calórica aproximada de 3,8 kcal/100g, administrada ad libitum.
5.3.2 Dieta com muita baixa quantidade de lipídios e alta quantidade de carboidratos
Os animais dos grupos low fat receberão alimentos que tenham muito pouca quantidade de lipídios (máximo 1% em gramas do alimento, visto que o padrão para roedores é 4%), grande quantidade de carboidratos acima de 65% das calorias totais (MOREIRA et al., 2012) e pobre em fibras.
O grupo low fat receberá ração feita com os seguintes ingredientes: tapioca, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento químico (Tabela 1). Está ração possui 81,25% de carboidratos, 15,26% de proteínas e 3,49% de lipídeos das calorias totais. Densidade calórica= 2,57 kcal/100g.
O grupo low fat com sacarose receberá dieta rica em carboidratos e sacarose e pobre em gorduras. A ração será feita com os seguintes ingredientes: tapioca, sacarose, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento químico (Tabela 2). Está ração será composta por carboidratos 84,10%, proteínas 12,95% e lipídios 2,94% do total de energia. Densidade calórica= 3,05 kcal/100g.
O grupo low fat com glicose receberá dieta rica em carboidratos e glicose e pobre em gorduras. A ração será feita com os seguintes ingredientes: tapioca, glicose, amido de milho, albumina, óleo de canola e fermento (Tabela 3). Está ração será composta por 83,75% de carboidratos, proteínas 13,22% e lipídios 3,03% das calorias totais. Densidade calórica= 2,97 kcal/100g.
5.3.3 Dieta com alta quantidade de lipídios e muito baixa quantidade de carboidratos (cetogênica)
Os animais do grupo da dieta cetogênica receberão alimentos que possuam grande quantidade de lipídios, ou seja, mais do que 50% das calorias totais provenientes das gorduras (WEBER et al., 2019). A dieta cetogênica permite um consumo muito baixo de carboidratos (em torno de 5% a 10% da ingestão calórica total ou abaixo de 50g por dia) como meio de aumentar a produção de cetonas (PAOLI et al., 2019).
A ração será feita com os seguintes ingredientes: albumina, banha, óleo de canola e farelo de trigo (Tabela 3). Está ração será composta por 7,27% de carboidratos, 12,44% de proteínas e 80,28% de lipídios provenientes do total de calorias. Densidade calórica= 6,26 kcal/100g.
5.4 Consumo alimentar e ingestão de líquidos totais
O consumo alimentar e de líquidos totais será avaliado diariamente na caixa de moradia, colocando-se uma quantidade conhecida de alimento e após 24h quantificar as sobras. O resultado será obtido dividindo-se essa quantidade pelo número de camundongos que habitam a caixa, expressos pela média de consumo por animal.
5.5. Peso e Composição Corporal
O monitoramento do peso dos animais será realizado semanalmente, em balança digital, os animais serão pesados individualmente e os valores de peso serão registrados em planilhas específicas. A partir dos dados de peso obtido será calculado o ganho de peso dos animais semanalmente e no final do experimento.
5.6. Testes glicêmicos
No final do período de tratamento serão realizados os testes glicêmicos sendo estes: Teste de tolerância à glicose (TTG) e Teste de tolerância à insulina (ITT). Para o TTG será aplicada uma solução de glicose (2 g/kg p.v. i.p.), após 6 horas de jejum, e a glicemia medida nos tempos -15, 0, 15, 30 e 60 minutos relativos ao momento da aplicação. Para o ITT os animais receberão uma injeção de insulina regular Novolin® R, Novo Nordisk®, Montes Claros, Minas Gerais, (0,5 UI/kg p.v. i.p.), após 2 horas de jejum, e a glicemia será medida nos tempos -15, 0, 5, 20 e 35 minutos relativos ao momento da aplicação. Os testes terão um intervalo de 03 dias entre eles para o controle do estresse.
5.7. Análises de secreção de insulina in vivo
A secreção de insulina in vivo será analisada em animais anestesiados com pentobarbital intraperitoneal (25mg/kg PV, volume final entre 200 e 300 mcrL dependendo do peso do animal), e submetidos a uma injeção de glicose (1g/kg PV, em solução a 10%, volume final entre 200 e 300 mcrL dependendo do peso do animal) intraperitoneal. Amostras de sangue (100 mcrL) serão coletados dos animais anestesiados através de punção retrorbital nos tempos 0, 3, 10, 20, e 30 minutos após a injeção. A insulina sérica será medida através de ELISA. Para isso será necessário apenas 10 mcrL de plasma para cada análise, considerando a necessidade do teste ser feito em duplicata, 20 mcrL de plasma para cada coleta. Os animais serão eutanasiados após a última coleta.
5.8 Testes de Comportamento
Serão realizados alguns testes a fim de se determinar alterações comportamentais entre os grupos. Durante os primeiros e últimos dias do tratamento, os animais serão filmados na primeira hora depois do início do acesso para verificar o tempo e a frequência dos animais junto ao recipiente de solução adocicada. Outra análise será o Teste do Intruso/Residente onde os animais serão pesados e transferidos para gaiolas individuais. Após dois dias, um intruso, do mesmo grupo e peso, será introduzido na gaiola por 10 min e o comportamento do residente será filmado. A latência para o primeiro ataque, o número de ataques e a duração dos ataques serão analisados.
5.9 Coleta de Tecidos
O método de eutanásia será exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano. A confirmação da morte se dará pela verificação dos seguintes sinais: ausência de movimento respiratório, ausência de batimentos cardíacos, ausência de pulsação, mucosas pálidas e perda do reflexo corneal. A execução da técnica e a confirmação da morte serão realizadas por um profissional qualificado para esse fim e supervisionadas por um médico veterinário.
O sangue será coletado por punção cardíaca em tubos contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), e mantido em gelo até a centrifugação para separar o plasma das células. As duas frações serão então congeladas e mantidas a -20o C até sua utilização. Tecidos serão coletados, pesados e terão fragmentos congelados em nitrogênio líquido para extração de ácido ribonucleico (RNA) e outro fragmento conservado em solução a 10% de formol tamponado para histologia. Serão coletados tecidos adiposos epididimal, perirenal, lombar intraescapular e marrom. Também serão coletados cérebro, rins, coração, fígado e glândulas adrenais. Os períodos de jejum estão dentro das normas do CONCEA.
5.10 Análises morfológicas
Fragmentos de cérebro, fígado, coração e tecido adiposo conservados em formalina tamponada serão utilizados em análises histológicas que serão feitas por coloração com hematoxilina e eosina por laboratório contratado.
5.11 Análises de expressão gênica
PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) será usado para determinar os níveis de expressão do gene da leptina no fígado, tecido adiposo e músculo esquelético e hipotálamo.
Brevemente: fragmentos de tecido de animais após 08 horas de jejum serão coletados e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. O RNA total das amostras será extraído usando-se um kit de extração e purificação de RNA por colunas. A integridade do RNA será analisada por eletroforese em gel de agarose e a concentração medida por espectrofotometria.
O ácido desoxirribonucleico (DNA) complementar (cDNA) será sintetizado usando kit contendo trancriptase reversa, DNTPs, e iniciadores randômicos de oligonucleotídeos.
Indicadores, Metas e Resultados
Tratamento dos animais com dietas;
Eutanásia e coleta de tecidos;
Análises laboratoriais;
Redação de resumos; apresentações e artigos científicos.
Eutanásia e coleta de tecidos;
Análises laboratoriais;
Redação de resumos; apresentações e artigos científicos.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| AMANDA BARBOSA ATRIB | |||
| AUGUSTO SCHNEIDER | 4 | ||
| CARLOS CASTILHO DE BARROS | 8 | ||
| CLÉDIA SILVEIRA FLORES DA SILVA |