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A exposição simultânea de herbicidas e MPs é comumente encontrada no meio ambiente, os microplásticos podem se vincular a tóxicos, causando o processo de bioacumulação e biomagnificação, o que resulta em uma transferência de contaminantes em níveis tróficos baixos, até níveis tróficos mais altos, deixando os ecossistemas mais suscetíveis aos contaminantes (de Sá et al., 2015; Chen et al., 2021; Peng et al., 2015, Hu et al., 2021). É significativo determinar a relação de afinidade de MPs com agrotóxicos, pois foi relatado que microplásticos podem carregar pesticidas por grandes distâncias em áreas úmidas, tendo maior potencial de ação nos ecossistemas marinhos e de água doce (Lajmanovich et al., 2021).
Estudos demonstram que a atividade conjunta do glifosato com outros contaminantes pode potencializar a ação nociva em organismos não-alvo. Segundo Uy et al (2022) larvas do peixe grunion da Califórnia (Leuresthes tenuis) quando alimentadas com artêmias que foram expostas a altas concentrações de partículas de microplásticos, tiveram taxas de crescimento reduzidas e alta mortalidade, mostrando assim, a transferência trófica de MPs em organismos aquáticos. Ensaios ecotoxicológicos realizados com MPs e glifosato evidenciaram disbiose e alterações a composição da microbiota intestinal da carpa comum (Cyprinus carpio). As partículas de MP (125–250 µm) são absorvidas pela carpa, e a exposição ao glifosato levou a quebra permeabilidade da barreira hematoencefálica; e a inibição da atividade da enzima acetilcolinesterasa (AChE). A ação do microplástico ou glifosato sozinho provocou alterações histológicas no intestino da carpa, e essas alterações foram mais acentuadas após a exposição conjunta dos microplásticos com o glifosato, tendo uma ação maléfica dos contaminantes (Chen et al., 2022). Em outro estudo, foi registrado que o efeito de herbicidas a base de glifosato e glufosinato de amônio em conjunto com partículas microplásticas de polietileno (40–48 μm) alteram as atividades das enzimas AChE, carboxilesterease (CbE) e glutationa-S-transferase (GST) sob exposição de girinos Scinax squalirostris, por 48h (Lajmanovich et al., 2022). A exposição prolongada de diferentes formulações químicas de glifosato quando combinadas com microesferas de polietileno e tereftalato de polietileno (PET) aumentaram significativamente a mortalidade de pequenos crustáceos como Daphnia magna (Zocchi et al., 2019). E dentre os grupos não-alvo afetados pelo uso do glifosato, embriões de peixe-rei Odontesthes humensis quando expostos a concentrações baixas e realísticas de glifosato (0,36mg/L-1) tiveram uma redução no diâmetro dos olhos, e na distância entre os olhos (Zebral et al., 2017).

Coleta dos embriões, larvicultura e aclimatação das larvas
Ovos fertilizados do peixe-rei Odontesthes argentinensis serão coletados na zona de varrido da Praia do Cassino em Rio Grande (RS) e transferidos para o Laboratório de Fisiologia de Animais Aquáticos da UFPel. A incubação dos ovos será realizada em um tanque com 180L, em uma temperatura controlada (22°C), sob aeração constante, fotoperíodo natural, salinidade em 10ppm e pH 7,5. Após a eclosão e um período de aclimatação de 5 dias sob os mesmos parâmetros de qualidade da água, se dará início ao experimento.

Bioensaio de exposição
O experimento se dará de forma individualizada e em grupo. O ensaio em grupo será realizado em triplicata com 30 indivíduos por replica, onde cada unidade experimental será composta por aquários de 36L. Para o ensaio individual serão 10 indivíduos, cada indivíduo representando uma réplica, e as unidades experimentais serão compostas por recipientes de 70mL.
Os animais serão submetidos a cinco tratamentos de exposição 0,36 e 1,80mg/L de glifosato em equivalente ácido (ae) como Roundup Transorb® (RT), com ou sem adição de 30 unidades de MP/L, além do grupo controle (sem a adição de herbicida e ou microplástico), durante o período de 96h sem a renovação do meio. Os MPs empregados são de polietileno, com 600um de diâmetro médio, de cor branca e densidade média (0,92-0,94 g/cm3).
Durante a exposição, os animais serão alimentados ad libitum duas vezes ao dia, com náuplios de Artemia sp. (4 náuplios/mL) conforme indicado por SAMPAIO E PIEDRAS, 2010. A cada 24h amostras de água serão coletadas para avaliar a qualidade da água com o intuito de manter os níveis adequados de oxigênio dissolvido, temperatura, pH e resíduos nitrogenados em forma de NH3, NO2- e NO3-. O pH e os compostos nitrogenados serão avaliados por kits colorimétricos comerciais (LabCon Test®).

Ensaio predatório
O ensaio de predação será realizado após a exposição aguda das larvas aos tratamentos, e o tempo para predação será de 3 min conforme sugerido por DE SÁ et al., 2014. O fornecimento de alimento será interrompido 24h antes do ensaio predatório (em 78h de exposição) para que dê tempo suficiente das larvas sentirem fome, e a densidade de presas será de 4 náuplios/mL + 4 MP/mL.
Após o período de predação, no encerramento do teste, as larvas serão eutanasiadas com sedação aprofundada até parada respiratória, em banho de benzocaína (250ppm), e serão realizadas as medidas de peso (0,0001g) e comprimento total (0,01cm). Posteriormente o desempenho predatório das larvas será determinado pelo número de artêmias e MPs ingeridos e analisados no trato gastrintestinal das larvas de peixe-rei.

Análise estatística
Os dados obtidos através da biometria serão expressos como média ± desvio padrão, e analisados por ANOVA fatorial, seguida pelo teste post-hoc de Tukey, sob nível de significância de 95%. As pressuposições para aplicação de ANOVA foram verificadas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov (normalidade), empregando o software Statistica8®. As variáveis relativas as taxas de sobrevivência e predação serão matematicamente transformadas para atender os pré-requisitos paramétricos.
A estimativa do tamanho amostral para o ensaio em grupos de 30 exemplares foi realizada a partir da fórmula para o cálculo do intervalo de confiança da média. Para tanto foram empregados os parâmetros de variância apresentados no artigo de DE SÁ et al., 2014.

Espera-se atestar a hipótese de que a ação conjunta de herbicida glifosato (N-fosfonometil-glicina) na formulação Roundup Transorb® e partículas de microplásticos de polietileno, podem modificar e comprometer o comportamento predatório do peixe-rei Odontesthes argentinensis.