Nome do Projeto
Efeitos da superexpressão da calicreína tecidual (KLK1) na homeostase do magnésio
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/04/2023 - 31/03/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
O Sistema Kallikrein-Kinin (KKS) participa de várias funções reguladoras no corpo, destacando processos inflamatórios, coagulação do sangue e regulação da homeostase da glicose e da pressão arterial. Este sistema é composto por dois conjuntos de substratos e enzimas, que geram os peptídeos efetores chamados cininas. Um dos conjuntos é composto por moléculas circulantes, como o substrato cininogênio, que é clivado por calicreínas e outras enzimas circulantes, produzindo assim cininas circulantes. O segundo conjunto tem fatores semelhantes produzidos na maioria dos tecidos, como cininogênio tecidual, calicreínas teciduais e outros fatores, que resultam na produção de cininas dentro dos tecidos. O objetivo deste projeto é verificar a ação da calicreína tecidual KLK1 sobre a homeostase iônica Mg no organismo. Para isso, um rato transgênico que expresse maior quantidade de KLK1 será comparado com seus controles, no que diz respeito à concentração sérica, óssea e urinária de vários íons importantes na regulação de Mg, inclusive, e na expressão de fatores proteicos relacionados ao transporte desses íons na absorção no intestino e na secreção nos rins. Essa análise de expressão será feita inicialmente por meio de qPCR para identificar alterações nas expressões de mRNA e, em seguida, por Western Blot, para verificar mudanças nas quantidades efetivas desses fatores proteicos, bem como alterações alostéricas regulatórias nesses fatores. Como resultado, esperamos identificar novos mecanismos de regulação do Mg e sua relação com a ação da KLK1 nos tecidos renais e no intestino. Esse novo conhecimento pode ser importante para o desenvolvimento de tratamentos para doenças relacionadas ao desequilíbrio no metabolismo de Mg em humanos.

Objetivo Geral

O objetivo deste trabalho é analisar a expressão gênica, a concentração plasmática, a concentração óssea e a concentração urinária de diversos minerais e fatores proteicos, a fim de elucidar o mecanismo e a participação da KLK1 na redução da excreção de sódio

Justificativa

Hipomagnesemia e hipermagnesemia são duas condições patológicas que podem ter sérias consequências para o paciente. A hipomagnesemia tem uma prevalência de 15% na população geral e até 65% em pacientes em unidades de terapia intensiva. Pode ser secundária à absorção intestinal materna ou ao aumento da secreção renal influenciada por hormônios ou drogas. Também está associada à hipocalemia, que é mediada pela estimulação do canal ROMK, o que resulta em aumento da excreção de potássio. Também está associada à hipocalcemia secundária à diminuição do PTH ou resistência hormonal. As manifestações clínicas incluem fadiga, fraqueza muscular, cãibras, tetania, tontura com funções e arritmias. A hipermagnesemia pode ser causada pelo aumento da ingestão e absorção intestinal e está relacionada ao consumo de antiácidos laxantes e enemas. Também pode estar relacionado à injeção de magnésio no caso de uma eclâmpsia. Os sintomas incluem náuseas, vômitos, distúrbios neurológicos, hipotensão e alterações no eletrocardiograma. Um nível muito alto de envenenamento por magnésio pode causar bloqueio cardíaco, paralisia respiratória, coma e choque.
O presente estudo pretende revelar novas características na homeostase do magnésio.

Metodologia

1- Medidas de magnésio tecidual: Para confirmar o aumento da reabsorção renal de Mg em TGR (hKLK1) em comparação com ratos controle, os níveis de Mg tecidual (rim e coração) serão quantificados usando kits comercialmente disponíveis.
2- RT-qPCR: A análise da expressão gênica de proteínas renais de manipulação de Mg, incluindo Kkl1, Trpm6, Trpm7, Cnnm2, Clnd2, Clnd16 e Cldn19, será realizada em amostras renais de ratos controle e transgênicos para investigar se o transgene modula os genes de expressão que participam da reabsorção renal de Mg.
3- Western blot: Genes selecionados de análises RT-qPCR que apresentem uma mudança expressiva serão validados com análise proteica por western blot, se houver anticorpos disponíveis. Além disso, a quantidade e o estado de fosforilação dos dois principais transportadores de Mg, TRPM6 e TRPM7, serão quantificados usando western blots para investigar se o aumento da KKL1 renal em TGR (hKLK1) modula
Metodologia a atividade destes canais permeáveis de Mg.
4- Imuno-histoquímica: A localização celular de TRPM6 e TRPM7 será investigada usando imuno-histoquímica, cortes renais serão incubados com anticorpos contra essas duas proteínas e microscopia confocal aplicada para verificar se KKL1 estabiliza os transportadores na membrana celular de TGR (hKLK1) e, assim, aumento da reabsorção de Mg

Indicadores, Metas e Resultados

Resultados de expressão genética, expressão de proteínas e análises clinicas

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ALICE SCHEER COELHO
AUGUSTO SCHNEIDER2
CARLOS CASTILHO DE BARROS4
CLÉDIA SILVEIRA FLORES DA SILVA

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