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Apesar de haver um conhecimento já bem estabelecido sobre os tipos de sinais elétricos (PA ou VP) em plantas e suas relações na sinalização de curta e longa distância de algumas respostas fisiológicas, nada ainda foi estudado sobre a dinâmica temporal dos sinais elétricos e possíveis relações com o estado fisiológico das plantas. Os estudos atuais estão restritos às análises da amplitude e velocidade das respostas elétricas, sem considerar a complexidade da dinâmica temporal do sinal em si durante eventos de sinalização pós-estimulação.
Em animais, particularmente em seres humanos, estudos com análise da dinâmica temporal de sinais elétricos obtidos com eletroencefalogramas (EEG) tem permitido estabelecer relações consistentes entre o estado de saúde de indivíduos com medidas de complexidade em dados de EEG. Por exemplo, reduções drásticas na complexidade de sinais de EEG foram associadas a ataques epiléticos em humanos (Srinivasan et al., 2007). Similarmente, análises da dinâmica temporal de EEG em pacientes com Alzheimer identificaram uma redução na irregularidade (complexidade) no EEG (Abásalo et al., 2005). Além disso, foi possível estabelecer uma correlação consistente entre a variação da complexidade da dinâmica em EEG e os estados de consciência (sono e vigília) em humanos (Burioka et al., 2005). Gardiner (2012 e 2013) tem sugerido a possibilidade de utilizar EEG em plantas para relacionar possíveis padrões de dinâmica temporal com diferentes estados fisiológicos. Mas, até onde pudemos encontrar, ainda não há nenhum tipo de estudo nessa direção.
Relações entre a variação na complexidade de séries temporais de parâmetros fisiológicos e o estado de plantas submetidas a diferentes condições ambientais foram previamente estudadas por Souza et al. (2004a, 2004b, 2005). Aumentos no déficit de pressão de vapor do ar induziram um aumento na complexidade da dinâmica da assimilação de CO2 e uma redução na dinâmica da condutância estomática em Citrus sinensis (Souza et al., 2004a). Em duas espécies tropicais arbóreas, a deficiência hídrica tendeu a aumentar a complexidade da dinâmica do fluxo de seiva (Souza et al., 2004b). Segundo Souza et al. (2005) existe uma relação entre a complexidade dos processos fisiológicos e a capacidade da planta de lidar com as flutuações ambientais, sugerindo que sistemas com dinâmicas mais complexas tenderiam a suportar melhor as variações ambientais por conferir ao sistema maior estabilidade.
Com a evolução da tecnologia para se captar os sinais elétricos emitidos pelas plantas, poderemos identificar padrões temporais nesses sinais, associando-os aos estímulos que os causaram. Essa relação pode auxiliar no entendimento da sinalização e comunicação estabelecida pelas plantas em situações adversas. Ao entendermos a sinalização elétrica e seus efeitos, estaremos a um passo de poder dar um diagnóstico sobre o estado em que uma planta se encontra, de forma segura e minimamente invasiva, de modo similar ao sistema utilizado na medicina humana ao se realizar um EEG ou um ECG. Mais que isso, o advento dessa nova área de estudos, a cerca da dinâmica temporal da sinalização elétrica em plantas, nos faz sugerir que uma relação planta-computador, como recentemente explorada em animais e humanos, seria viável. Sugerimos que estudos aprofundando o significado fisiológico da dinâmica elétrica em plantas, poderia vir a permitir o desenvolvimento de uma tecnologia totalmente nova de sensores ambientais baseados nas respostas elétricas das próprias plantas ao seu meio.
Com o auxílio da tecnologia computacional e modelos matemáticos, podemos capturar, interpretar e codificar a sinalização elétrica de uma planta, transformando-a numa “linguagem”, que nos ajudará a compreender melhor a fisiologia vegetal ao nível de indivíduo, e sua complexa interação com o ambiente. Assim, um estudo mais amplo e detalhado da interpretação dos sinais bioelétricos das plantas pode contribuir para uma melhor compreensão dos princípios e normas que regem o comportamento organizacional das plantas e, a partir disso, estabelecer modelos bioelétricos.

Material Vegetal

Para todos os experimentos sementes de soja (Glicine max, cv. Intacta Bt/RR) germinarão no Fitotron em vasos de 180 ml, tendo como substrato a vermiculita. Os vasos (n = 30, para cada experimento) serão mantidos em capacidade máxima de retenção de água durante a germinação e desenvolvimento inicial das plântulas. As plantas serão irrigadas diariamente, no período da manhã com solução nutritiva “Hoagland”. O volume da irrigação será determinado após pesagem dos vasos com sua capacidade máxima de retenção de água e verificação da perda diária por evapotranspiração.
Além disso, a depender de interesses específicos outras espécies cultivadas poderão a ser utilizadas como modelo experimental.

Sessões Experimentais

No dia anterior de cada sessão experimental eletrodos de agulha serão introduzidos no caule das plantas de soja para aclimatação. Os eletrodos serão imersos em um gel condutor comumente utilizado em exames de EEG, antes de serem inseridos. A aclimatação aos eletrodos é necessária pois sua inserção induz potenciais de ação e flutuações na variação de potencial no local, sendo estabilizados em algumas horas com o desaparecimento dos potenciais de ação (Volkov and Haack, 1995). Em cada sessão experimental serão coletados dados de quatro plantas simultaneamente, utilizando-se um total de 30 plantas para cada sessão. A coleta de dados se iniciará após o período de aclimatação e cobrirá um total de 2 horas, sendo 1 hora antes e 1 hora após a aplicação do estímulo. O monitoramento será feito de forma contínua, inclusive após e durante a indução dos estímulos ambientais, de modo a possibilitar a captação de eventuais transientes.
Para o desenvolvimento do projeto de pesquisa, serão realizados uma série de experimentos visando a coleta dos sinais bioelétricos evocados das plantas submetidas a diferentes estímulos, com a finalidade de comparar as características dos sinais bioelétricos antes e depois da aplicação de cada estímulo. Os estímulos serão aplicados na fase V1 das plantas (primeiro trifólio expandido). Os ensaios 4.3.1 a 4.3.3, já realizados em Presidente Prudente, serão analisados de acordo com métodos indicados no item 4.5, com a finalidade de estabelecer os protocolos de análises e iniciar a investigação a cerca dos possíveis padrões elétricos em respostas a estímulos específicos.
O ensaio 4.3.4 será realizado com o intuito de tentar estabelecer uma correlação entre os sinais elétricos e alguns parâmetros fisiológicos, descritos adiante.

Choque osmótico: Será adicionado aos vasos 50 ml de solução de manitol com concentração equivalente a um potencial osmótico de – 4,0 MPa.

Choques de temperatura: As plantas serão submetidas a dois tratamentos de temperatura, totalmente independentes entre si, com temperatura alta de 40 ºC e de temperatura baixa de 10 ºC, sempre partindo da temperatura base de cultivo de 29 ± 0,27 °C durante o dia.

Sombreamento: As plantas expostas à irradiância das condições de cultivo padrão do Fitotron (500 μmols m-1 s-1) serão submetidas a uma súbita redução de DFFFA para 40 μmols m-1 s-1. O sombreamento será induzido por meio do uso de telas de sombreamento e desligamento parcial das lâmpadas do Fitotron.

Deficiência hídrica: Será suspensa a irrigação dos vasos até atingirem o peso equivalente a 30% do volume de água máximo, determinado previamente por método gravimétrico. O monitoramento da porcentagem de água será realizado com um sensor de umidade de solo (EC-5, Decagon Devices, Pullman, USA) acoplado a um dataloger (ECH2O Check, Decagon Devices, Pullman, USA).
Paralelamente a coleta dos sinais elétricos, sensores magnéticos de pressão de turgor (Magnetic Leaf Turgor Pressure Probe, Zim Plant Technology, Berlim, Alemanha) serão instalados nas plantas com o objetivo de coletar séries temporais da variação da pressão de turgor foliar para o estudo de correlações com os sinais elétricos.

Medidas de trocas gasosas, com um medidor de trocas gasosas por infra-vermelho (LI-6400, Li-Cor, Nebraska, EUA), serão realizadas de forma contínua, com intervalos de 5 segundos (Souza et al., 2005), com a finalidade de gerar séries temporais para estudos de correlação com os sinais elétricos. Todavia, como o sistema deve ser montado dentro de uma Gaiola de Faraday, não sabemos se o ruídos elétrico gerado pelo LI-6400 poderá interferir nas leituras dos sinais elétricos. Assim, alguns testes preliminares serão realizados para garantir a viabilidade da coleta simultânea dos dados de trocas gasosas e dos sinais elétricos. O teste será realizado com as seguintes condições na câmara de amostragem do LI-6400: irradiância 500 μmols m-1 s-1, temperatura de 28 oC, CO2 em 400 μmols mol-1.
Captação dos sinais bioelétricos

Todas as medidas bioelétricas serão conduzidas dentro de uma “Gaiola de Faraday”, devidamente aterrada, para evitar ruídos eletromagnéticos provenientes da rede elétrica do laboratório (tipicamente de 60 Hz). Séries temporais de dados bioelétricos serão obtidos utilizando um sistema de aquisição eletrônica de 4 canais (MP36 - BIOPAC, Biopac Systems, Inc.), com alta impedância de entrada. Os sinais serão amplificados e filtrados utilizando-se dois filtros, um “high-pass” (frequência de corte 0.5 Hz) e um “low-pass” (frequência de corte 1.5 KHz). Os sinais elétricos serão coletados a uma frequência de amostragem de 125 Hz (125 dados por segundo), com um ganho (amplificação) de 20.000 vezes. O MP36 possui um microprocessador interno que controla a aquisição de dados, convertendo-os em sinais digitais, realizando também a comunicação com o computador. O sistema MP36 será conectado a dois eletrodos de agulha (EL452), um positivo (+) e um negativo (-), por meio de um cabo transdutor blindado com alta impedância de entrada (≈ 109 Ω) (modulo SS2LA). Para capturar os sinais elétricos evocados pelas plantas usaremos um protocolo de EEG (0.5 – 100 HZ, com “notch” em 60 HZ). Os dados coletados serão pré-analisados utilizando o software Biopac Student Lab 3.7.6.

Processamento e análise dos sinais

Análises descritivas e quantitativas

Pretendemos efetuar as seguintes análises estatísticas:
• Verificar se a série é estacionaria ou não (análise visual dos dados para a verificação da existência de tendências).
• Calcular o expoente de Hurst H, pelo método R/S (Hurst, 1951). Esse expoente quantifica se a série é aleatória ou é correlacionada temporalmente (efeito de memória que dá surgimento de persistência ou anti-persistência).
• Análise da densidade espectral (ESD) via transformada rápida de Fourier (FFT). Nesta etapa podemos determinar a existência ou não de frequências dominantes e também podemos determinar o tipo de ruído a partir do valor do expoente β do decaimento da ESD com a frequência (ESD ~ f-β), cuja dependência com expoente de Hurst é dada pela relação β=2H+1 (Williams, 1997).
• Calcular a função de auto-correlação de Pearson, que informa o tipo de correlação: de longo ou curto alcance (Pearson, 1895).
• Quantificar o nível de organização/desorganização do sistema (complexidade das séries temporais), antes e depois do tratamento. O forte candidato para essa análise é o método da Entropia Aproximada ApEn (Pincus, 1991), já utilizado em dados de fisiologia de plantas (Souza et al. 2004a) e em análises de EEG (Abásolo et al., 2005).
• Para verificar uma possível ocorrência de dinâmicas caóticas em nossas séries, pretendemos calcular o maior expoente de Lyapunov (Williams, 1997).
Todos os parâmetros acima serão calculados a partir de programas computacionais desenvolvidos em linguagem de programação C, não sendo necessária a aquisição de softwares proprietários.

Reconhecimento de padrões

Para verificar a ocorrência de padrões de respostas estímulo-específico utilizaremos a técnica de bi-cluster. Esta técnica possibilita encontrar subgrupos que exibem comportamentos altamente correlacionados em séries de dados distintas, sendo recentemente utilizada para detecção de padrões em big data de biologia molecular (Madeira et al., 2010; Henriques e Madeira, 2014).
Esta técnica consiste em tomar um grupo de séries temporais simultâneas, obtendo uma matriz cujas linhas são as séries de dados e as colunas os instantes de tempo. Nessa matriz os bi-clusters podem identificar instantes de tempo onde as séries apresentam um comportamento coerente, por exemplo, oscilando com a mesma frequência. Madeira et al. (2010) propuseram um algoritmo capaz de enumerar todos os bi-clusters de colunas contiguas (algoritmo CCC), permitindo assim o reconhecimento de padrões das séries analisadas.
Entretanto, como esse tipo de modelagem nunca foi feita com o tipo de dado gerado em nosso estudo, não será descartada a possibilidade de testar outros modelos de busca de padrões como, por exemplo, redes neurais artificiais (Srinivasan et al., 2007).

Dentro deste contexto, os seguintes resultados são esperados:

1. Flutuações do ambiente são percebidas pelas plantas e desencadeiam uma resposta elétrica.
2. Diferentes fatores ambientais podem desencadear diferentes padrões de respostas biolétricas específicas.
3. Existem padrões matemáticos que descrevem o comportamento dos sinais bioelétricos em cada condição ambiental como, por exemplo, alteração na complexidade dos sinais entre o estado estimulado e não-estimulado.