Nome do Projeto
Filogenia e taxonomia da tribo Drosophilini Okada, 1989 (Drosophilidae, Diptera): uma abordagem integrativa
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/09/2023 - 31/08/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A taxonomia vem se desenvolvendo de forma a integrar diferentes ferramentas e evidências no teste de hipóteses, como os aspectos da morfologia dos indivíduos e a estrutura de suas moléculas. Essa nova abordagem é denominada taxonomia integrativa. Os entomólogos têm adotado essa metodologia, que agiliza a obtenção de resultados e proporciona maior segurança nas inferências de espécies ou mesmo nas relações evolutivas entre elas, visto que há múltiplas fontes de evidência abordando as mesmas questões. No entanto, ainda há grandes lacunas de conhecimento sobre a sistemática e taxonomia da maioria dos grupos de insetos, inclusive Drosophilidae (Diptera) - uma das famílias de moscas mais estudadas. Dentre os grupos historicamente negligenciados dessa família, estão os gêneros Hirtodrosophila, Mycodrosophila, Paraliodrosophila, Paramycodrosophila e Zygothrica, que compõem a tribo Drosophilini, assim como o conhecido gênero Drosophila. Portanto, os objetivos deste projeto são testar a hipótese de monofilia dos gêneros Mycodrosophila, Paraliodrosophila e Paramycodrosophila, avançar na delimitação de Hirtodrosophila e Zygothrica, que têm se mostrado não-monofiléticos, e verificar as relações filogenéticas entre eles e os demais gêneros da tribo Drosophilini. Paralelamente, buscamos testar a delimitação das espécies estudadas por meio de evidências morfológicas, moleculares e ecológicas, promovendo uma taxonomia integrativa das espécies. Para alcançar esses objetivos, serão analisados aspectos morfológicos, sequências de genes nucleares e mitocondriais para a inferência de filogenias com múltiplas evidências e modelagem de nicho ecológico. Adicionalmente, a utilização das técnicas de DNA Barcode auxiliará na delimitação das espécies estudadas, em complementaridade com a diagnose morfológica e as evidências ecológicas.

Objetivo Geral

A presente proposta estabelece os seguintes objetivos gerais:
1. Inferir uma hipótese filogenética com amostragem taxonômica ampla, incluindo espécies das regiões Afrotropical, Australiana, Oriental, Neártica e Paleártica, bem como novas espécies da região Neotropical, a fim de obter uma resposta mais robusta quanto ao relacionamento entre os gêneros da tribo Drosophilini e delimitá-los de maneira a buscar maior estabilidade nomenclatural.
2. Testar a hipótese de monofilia dos gêneros Paraliodrosophila, Mycodrosophila e Paramycodrosophila, analisando as relações filogenéticas entre eles e os demais gêneros do grupo genérico Zygothrica.
3. Verificar a delimitação das espécies descritas através de evidências morfológicas, moleculares e ecológicas (através do estudo do nicho ecológico), promovendo assim uma taxonomia integrativa das espécies.

Já os objetivos específicos pretendem:
a. Integrar as fontes de informação morfológica e molecular para a realização das inferências filogenéticas.
b. Identificar exemplares de Drosophilidae coletados em diferentes biomas brasileiros, com foco nas espécies dos gêneros do grupo Zygothrica.
c. Identificar os exemplares depositados em coleções científicas entomológicas, expandindo o esforço para buscar material de fora da Região Neotropical.
d. Descrever novas espécies do grupo do gênero Zygothrica, caracterizando sua morfologia, com detalhamento da terminalia masculina e feminina.
e. Produzir sequências dos genes mitocondriais Citocromo Oxidase subunidade I (coI) e subunidade II (coII) para testar a delimitação das espécies através das técnicas de DNA Barcode com tais marcadores.
f. Produzir sequências dos genes nucleares alfa-metildopa (amd) e dopa descarboxilase (ddc) para gerar uma hipótese filogenética relacionando as espécies estudadas, utilizando esses genes em conjunto com os genes mitocondriais e dados morfológicos.

Justificativa

Este projeto de pesquisa propõe a utilização de uma abordagem integrativa para resolver as lacunas no conhecimento taxonômico e sistemático de certos gêneros da família Drosophilidae (Diptera), um grupo de insetos extensivamente estudado, porém com notáveis negligências em alguns de seus segmentos. A taxonomia integrativa, que incorpora diversas ferramentas e evidências - desde a morfologia dos indivíduos até a estrutura de suas moléculas - tem demonstrado ser uma estratégia eficiente e confiável para inferir espécies e suas relações evolutivas. Ao adotar essa abordagem, buscamos trazer resultados sólidos e acelerados, enriquecendo assim a compreensão taxonômica e evolutiva desses organismos.
A pesquisa focará em gêneros historicamente negligenciados, como Hirtodrosophila, Mycodrosophila, Paraliodrosophila, Paramycodrosophila e Zygothrica, todos pertencentes à tribo Drosophilini. A necessidade dessa investigação é premente, considerando as evidências sugerindo a não-monofilia de Hirtodrosophila e Zygothrica, bem como a ambiguidade em torno da monofilia de Mycodrosophila, Paraliodrosophila e Paramycodrosophila. Estudar essas questões contribuirá não apenas para uma melhor compreensão das relações dentro da tribo Drosophilini, mas também para a delimitação precisa das espécies em estudo.
A estratégia deste projeto engloba a análise morfológica, sequenciamento de genes nucleares e mitocondriais, modelagem de nicho ecológico, bem como o emprego da técnica de DNA Barcode. Combinando essas técnicas, buscamos produzir uma avaliação abrangente da diversidade, estrutura e inter-relações desses gêneros, aderindo à metodologia de taxonomia integrativa. Através da adoção dessa abordagem, pretendemos oferecer uma visão mais completa, robusta e multifacetada dos grupos de insetos em questão, promovendo assim uma maior precisão na delimitação das espécies e aprimorando a compreensão de suas inter-relações evolutivas.

Metodologia

Coleta de exemplares:
Para abordar lacunas de coleta no Brasil, realizaremos coletas de drosofilídeos em localidades estratégicas definidas por revisão de áreas já amostradas. Áreas com vegetação nativa preservada e não amostradas serão selecionadas para expedições de 3 a 10 dias, começando no Pampa Sulino e expandindo-se para outros domínios vegetacionais brasileiros.
Utilizaremos quatro metodologias de coleta para Drosophilidae. Os métodos passivos incluem armadilhas do tipo Malaise para interceptar insetos voadores, e armadilhas 'pan trap', compostas por pratos coloridos preenchidos com água e detergente, atraindo visualmente os insetos. Ambos os tipos de armadilha serão utilizados simultaneamente em diversos locais de coleta.
Os métodos ativos consistem na coleta de imaturos associados a fungos e plantas em decomposição, e na utilização de redes entomológicas para capturar insetos próximos à vegetação ou em substratos alimentares. As localidades de coleta e substratos serão documentados para análises filogenéticas futuras.
Todos os exemplares coletados serão preservados em álcool absoluto, e os usados para descrever novas espécies serão secos com hexametildisilisano (HMDS).

Revisão de exemplares depositados em museus e em posse temporária do Laboratório de Genética e Evolução de Insetos - UFPel:
Estamos identificando exemplares coletados entre 2019 e 2023 no sul do Rio Grande do Sul e em outros estados brasileiros. Também obtivemos amostras para estudo de coleções científicas brasileiras e estrangeiras, incluindo as coleções do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil (CEIOC); do Museu de Zoologia de São Paulo, São Paulo, Brasil (MZUSP); do Museu Paraense Emilio Goeldi, Belém, Brasil (MPEG); do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Brasil (INPA); do National Museum, Bloemfontein, África do Sul (BMSA); da Colección Entomológica Universidad de Antioquia, Medellín, Colômbia (CEUA). Devido à pandemia de coronavírus, o acesso a coleções internacionais, incluindo o American Museum of Natural History e o Muséum national d'Histoire naturelle, foi interrompido, mas será retomado assim que possível.

Identificação taxonômica:
As espécies de Drosophilidae serão identificadas por análise da morfologia externa e terminalia, utilizando metodologias de Martinelli et al. (2017) e Bächli et al. (2004) quando necessário. Os táxons de fungos e plantas coletados serão identificados por especialistas, com base em fotografias e exsicatas enviadas para professores do Departamento de Botânica.

DNA Barcode:
Usaremos DNA extraído de indivíduos de Drosophilidae para a abordagem de DNA Barcode, amplificando genes mitocondriais (coI e coII) via PCR. As sequências resultantes serão purificadas, sequenciadas por empresa terceirizada e analisadas com o pacote Staden. Confirmaremos a identidade das sequências com BLASTN, alinhando-as usando ClustalX 2. A detecção do Barcode GAP será medida com o modelo K2P, com delimitação de espécies via Máxima Verossimilhança (PAUP) e Análise Bayesiana (MrBayes), seguindo as orientações do jModelTest2.

Modelagem de Nicho Ecológico:
Pontos de ocorrência das espécies serão elencados a partir de coleções, museus e literatura, principalmente do banco de dados online Taxodros. As coordenadas geográficas serão conferidas e verificadas usando Google Maps. Outras informações como data de coleta e nome da localidade serão registradas quando disponíveis. Buscas adicionais serão feitas em sites de indexação de artigos, como o Periódico CAPES e o Google Scholar.
Ao consolidar os dados, discrepâncias serão verificadas com o software QGIS e os pontos de ocorrência ajustados ou eliminados conforme a necessidade. Excluiremos registros de construções humanas e pontos duplicados para minimizar o efeito do microclima.
Para modelagem de espécies, selecionaremos camadas bioclimáticas atualizadas, realizando modelagens a priori no software MaxEnt e avaliando a correlação de Pearson das camadas pelo pacote ENMTools da plataforma R. Camadas altamente correlacionadas serão consideradas para exclusão com base na contribuição para o modelo.
Com os dados de presença e as camadas ambientais, estimaremos mapas de adequabilidade ambiental das espécies no MaxEnt. Os modelos gerados serão validados pelos valores de AUC (área abaixo da curva ROC) e verificados por Jackknife para determinar as variáveis mais influentes.
Por fim, a sobreposição dos nichos abióticos será verificada usando o pacote ENMTools através do D de Schoener e do I de Warren, e testes de identidades para verificar a equivalência dos espaços geográficos das espécies.

Descrição de novas espécies:
Para a delimitação das novas espécies, utilizaremos evidências obtidas (i) nas análises de DNA Barcode; (ii) nas comparações morfológicas; e (iii) nas análises de sobreposição e identidade de nicho. Após a delimitação das espécies, realizaremos as descrições da morfologia das mesmas seguindo a terminologia de Cumming & Wood (2017) e Rice et al. (2019). Serão confeccionadas pranchas com fotomicrografias da morfologia externa dos indivíduos tomadas com fotoestereomicroscópio Zeiss Discovery V20 e das terminalias masculina e/ou feminina tomadas com a câmera de uma máquina fotográfica Canon EOS Rebel T3 acoplada em microscópio ótico Olympus BX51. As fotomicrografias serão tomadas em diversos planos focais e posteriormente fusionadas em uma imagem multifocal com auxílio do software Helicon Focus 7.6.6 Pro.

Análises filogenéticas:
Cerca de 100 espécies de Hirtodrosophila, Paraliodrosophila, Mycodrosophila, Paramycodrosophila e Zygothrica estão disponíveis para análises filogenéticas, com sequências de 30 espécies já prontas para análises moleculares. Espécies de outros gêneros de Drosophilini, Steganinae, Curtonotidae e Ephydridae funcionarão como grupos-externos, garantindo um enraizamento mais seguro da árvore.
As sequências dos genes nucleares alfa-metildopa (amd) e dopa descarboxilase (ddc), bem como os genes mitocondriais coI e coII serão obtidos para as análises filogenéticas. As sequências serão montadas e alinhadas usando o software Gap4 e Mega 6, respectivamente. Análises filogenéticas serão realizadas utilizando vários métodos e softwares, como Neighbor Joining e Máxima Parcimônia no PAUP, Máxima Verossimilhança no PhyML e Análise Bayesiana no MrBayes.
A congruência entre as diferentes partições será medida pelo teste de homogeneidade no PAUP e a probabilidade posterior de que diferentes partições compartilhem a mesma árvore será avaliada pela análise de concordância Bayesiana no software Bucky. Topologias alternativas serão comparadas utilizando os testes de Templeton e Shimodaira-Hasegawa.
Caracteres morfológicos, especialmente da terminalia masculina, serão eleitos para inferências filogenéticas. Grupos externos sucessivos serão usados para o enraizamento das árvores, com possíveis mudanças de acordo com os resultados das análises moleculares.
As análises filogenéticas baseadas em dados morfológicos serão realizadas usando o software TNT, com os cladogramas mais parcimoniosos obtidos por meio de algoritmos heurísticos. A evolução dos caracteres será analisada com o software Mesquite.
Finalmente, as inferências baseadas em métodos moleculares e morfológicos serão contrastadas e as matrizes de dados serão concatenadas. Uma análise Bayesiana será realizada no software Mr. Bayes, utilizando o modelo evolutivo Mk para a partição de dados morfológicos.

Indicadores, Metas e Resultados

Resultados esperados:
Os 48 meses de atividades previstos na presente proposta resultarão na organização sistemática de dezenas de espécies, com sua inclusão em novas hipóteses filogenéticas e caracterização taxonômica das mesmas. Tais informações potencializam a futura utilização destas espécies em estudos ecológicos, morfológicos e fisiológicos. Assim, como resultado direto da presente proposta, esperamos publicar 12 artigos em revista com importante impacto na área de Biodiversidade. Indiretamente, nossa proposta também gerará mais publicações, pois todo o material coletado das outras famílias de insetos será destinado à especialistas ou depositado em museus para futuros estudos. Os dados gerados de associação com recursos tróficos também podem subsidiar novas publicações, não previstas inicialmente como resultado direto do projeto.

Relevância e impacto do projeto para o desenvolvimento científico, tecnológico ou de inovação:
Além das publicações elencadas anteriormente, o presente projeto possibilitará a formação e desenvolvimento técnico-científico de alunos de graduação e pós-graduação. Atualmente, o proponente coorienta três acadêmicos em doutoramento (Robson Crepes Corrêa - PPG Biologia Animal/UFRGS, Lucas Baptista Duarte - PPG Biologia Animal/ UFRGS e Luana Amaral dos Santos - PPG Entomologia/UFPR), um mestrando no PPG Biologia Animal/UFRGS (Marcos Henrique Frech Telles) e duas acadêmicas de iniciação científica vinculadas ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas/UFPel (Bibiana Luizi Groff e Jessyca Siemionko de Antoni). Ao longo dos próximos 48 meses, o proponente deverá encerrar as orientações em andamento e tem uma estimativa de que vai abrir 10 novas vagas para orientação, entre estudantes da graduação e pós-graduação.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
BIBIANA LUIZI GROFF
MARCO ANTONIO TONUS MARINHO3
MARCO SILVA GOTTSCHALK5
MONICA LANER BLAUTH5
Robson Crepes Corrêa

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