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Este projeto de pesquisa propõe a utilização de uma abordagem integrativa para resolver as lacunas no conhecimento taxonômico e sistemático de certos gêneros da família Drosophilidae (Diptera), um grupo de insetos extensivamente estudado, porém com notáveis negligências em alguns de seus segmentos. A taxonomia integrativa, que incorpora diversas ferramentas e evidências - desde a morfologia dos indivíduos até a estrutura de suas moléculas - tem demonstrado ser uma estratégia eficiente e confiável para inferir espécies e suas relações evolutivas. Ao adotar essa abordagem, buscamos trazer resultados sólidos e acelerados, enriquecendo assim a compreensão taxonômica e evolutiva desses organismos.
A pesquisa focará em gêneros historicamente negligenciados, como Hirtodrosophila, Mycodrosophila, Paraliodrosophila, Paramycodrosophila e Zygothrica, todos pertencentes à tribo Drosophilini. A necessidade dessa investigação é premente, considerando as evidências sugerindo a não-monofilia de Hirtodrosophila e Zygothrica, bem como a ambiguidade em torno da monofilia de Mycodrosophila, Paraliodrosophila e Paramycodrosophila. Estudar essas questões contribuirá não apenas para uma melhor compreensão das relações dentro da tribo Drosophilini, mas também para a delimitação precisa das espécies em estudo.
A estratégia deste projeto engloba a análise morfológica, sequenciamento de genes nucleares e mitocondriais, modelagem de nicho ecológico, bem como o emprego da técnica de DNA Barcode. Combinando essas técnicas, buscamos produzir uma avaliação abrangente da diversidade, estrutura e inter-relações desses gêneros, aderindo à metodologia de taxonomia integrativa. Através da adoção dessa abordagem, pretendemos oferecer uma visão mais completa, robusta e multifacetada dos grupos de insetos em questão, promovendo assim uma maior precisão na delimitação das espécies e aprimorando a compreensão de suas inter-relações evolutivas.

Coleta de exemplares:
Para abordar lacunas de coleta no Brasil, realizaremos coletas de drosofilídeos em localidades estratégicas definidas por revisão de áreas já amostradas. Áreas com vegetação nativa preservada e não amostradas serão selecionadas para expedições de 3 a 10 dias, começando no Pampa Sulino e expandindo-se para outros domínios vegetacionais brasileiros.
Utilizaremos quatro metodologias de coleta para Drosophilidae. Os métodos passivos incluem armadilhas do tipo Malaise para interceptar insetos voadores, e armadilhas 'pan trap', compostas por pratos coloridos preenchidos com água e detergente, atraindo visualmente os insetos. Ambos os tipos de armadilha serão utilizados simultaneamente em diversos locais de coleta.
Os métodos ativos consistem na coleta de imaturos associados a fungos e plantas em decomposição, e na utilização de redes entomológicas para capturar insetos próximos à vegetação ou em substratos alimentares. As localidades de coleta e substratos serão documentados para análises filogenéticas futuras.
Todos os exemplares coletados serão preservados em álcool absoluto, e os usados para descrever novas espécies serão secos com hexametildisilisano (HMDS).

Revisão de exemplares depositados em museus e em posse temporária do Laboratório de Genética e Evolução de Insetos - UFPel:
Estamos identificando exemplares coletados entre 2019 e 2023 no sul do Rio Grande do Sul e em outros estados brasileiros. Também obtivemos amostras para estudo de coleções científicas brasileiras e estrangeiras, incluindo as coleções do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil (CEIOC); do Museu de Zoologia de São Paulo, São Paulo, Brasil (MZUSP); do Museu Paraense Emilio Goeldi, Belém, Brasil (MPEG); do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Brasil (INPA); do National Museum, Bloemfontein, África do Sul (BMSA); da Colección Entomológica Universidad de Antioquia, Medellín, Colômbia (CEUA). Devido à pandemia de coronavírus, o acesso a coleções internacionais, incluindo o American Museum of Natural History e o Muséum national d'Histoire naturelle, foi interrompido, mas será retomado assim que possível.

Identificação taxonômica:
As espécies de Drosophilidae serão identificadas por análise da morfologia externa e terminalia, utilizando metodologias de Martinelli et al. (2017) e Bächli et al. (2004) quando necessário. Os táxons de fungos e plantas coletados serão identificados por especialistas, com base em fotografias e exsicatas enviadas para professores do Departamento de Botânica.

DNA Barcode:
Usaremos DNA extraído de indivíduos de Drosophilidae para a abordagem de DNA Barcode, amplificando genes mitocondriais (coI e coII) via PCR. As sequências resultantes serão purificadas, sequenciadas por empresa terceirizada e analisadas com o pacote Staden. Confirmaremos a identidade das sequências com BLASTN, alinhando-as usando ClustalX 2. A detecção do Barcode GAP será medida com o modelo K2P, com delimitação de espécies via Máxima Verossimilhança (PAUP) e Análise Bayesiana (MrBayes), seguindo as orientações do jModelTest2.

Modelagem de Nicho Ecológico:
Pontos de ocorrência das espécies serão elencados a partir de coleções, museus e literatura, principalmente do banco de dados online Taxodros. As coordenadas geográficas serão conferidas e verificadas usando Google Maps. Outras informações como data de coleta e nome da localidade serão registradas quando disponíveis. Buscas adicionais serão feitas em sites de indexação de artigos, como o Periódico CAPES e o Google Scholar.
Ao consolidar os dados, discrepâncias serão verificadas com o software QGIS e os pontos de ocorrência ajustados ou eliminados conforme a necessidade. Excluiremos registros de construções humanas e pontos duplicados para minimizar o efeito do microclima.
Para modelagem de espécies, selecionaremos camadas bioclimáticas atualizadas, realizando modelagens a priori no software MaxEnt e avaliando a correlação de Pearson das camadas pelo pacote ENMTools da plataforma R. Camadas altamente correlacionadas serão consideradas para exclusão com base na contribuição para o modelo.
Com os dados de presença e as camadas ambientais, estimaremos mapas de adequabilidade ambiental das espécies no MaxEnt. Os modelos gerados serão validados pelos valores de AUC (área abaixo da curva ROC) e verificados por Jackknife para determinar as variáveis mais influentes.
Por fim, a sobreposição dos nichos abióticos será verificada usando o pacote ENMTools através do D de Schoener e do I de Warren, e testes de identidades para verificar a equivalência dos espaços geográficos das espécies.

Descrição de novas espécies:
Para a delimitação das novas espécies, utilizaremos evidências obtidas (i) nas análises de DNA Barcode; (ii) nas comparações morfológicas; e (iii) nas análises de sobreposição e identidade de nicho. Após a delimitação das espécies, realizaremos as descrições da morfologia das mesmas seguindo a terminologia de Cumming & Wood (2017) e Rice et al. (2019). Serão confeccionadas pranchas com fotomicrografias da morfologia externa dos indivíduos tomadas com fotoestereomicroscópio Zeiss Discovery V20 e das terminalias masculina e/ou feminina tomadas com a câmera de uma máquina fotográfica Canon EOS Rebel T3 acoplada em microscópio ótico Olympus BX51. As fotomicrografias serão tomadas em diversos planos focais e posteriormente fusionadas em uma imagem multifocal com auxílio do software Helicon Focus 7.6.6 Pro.

Análises filogenéticas:
Cerca de 100 espécies de Hirtodrosophila, Paraliodrosophila, Mycodrosophila, Paramycodrosophila e Zygothrica estão disponíveis para análises filogenéticas, com sequências de 30 espécies já prontas para análises moleculares. Espécies de outros gêneros de Drosophilini, Steganinae, Curtonotidae e Ephydridae funcionarão como grupos-externos, garantindo um enraizamento mais seguro da árvore.
As sequências dos genes nucleares alfa-metildopa (amd) e dopa descarboxilase (ddc), bem como os genes mitocondriais coI e coII serão obtidos para as análises filogenéticas. As sequências serão montadas e alinhadas usando o software Gap4 e Mega 6, respectivamente. Análises filogenéticas serão realizadas utilizando vários métodos e softwares, como Neighbor Joining e Máxima Parcimônia no PAUP, Máxima Verossimilhança no PhyML e Análise Bayesiana no MrBayes.
A congruência entre as diferentes partições será medida pelo teste de homogeneidade no PAUP e a probabilidade posterior de que diferentes partições compartilhem a mesma árvore será avaliada pela análise de concordância Bayesiana no software Bucky. Topologias alternativas serão comparadas utilizando os testes de Templeton e Shimodaira-Hasegawa.
Caracteres morfológicos, especialmente da terminalia masculina, serão eleitos para inferências filogenéticas. Grupos externos sucessivos serão usados para o enraizamento das árvores, com possíveis mudanças de acordo com os resultados das análises moleculares.
As análises filogenéticas baseadas em dados morfológicos serão realizadas usando o software TNT, com os cladogramas mais parcimoniosos obtidos por meio de algoritmos heurísticos. A evolução dos caracteres será analisada com o software Mesquite.
Finalmente, as inferências baseadas em métodos moleculares e morfológicos serão contrastadas e as matrizes de dados serão concatenadas. Uma análise Bayesiana será realizada no software Mr. Bayes, utilizando o modelo evolutivo Mk para a partição de dados morfológicos.

Resultados esperados:
Os 48 meses de atividades previstos na presente proposta resultarão na organização sistemática de dezenas de espécies, com sua inclusão em novas hipóteses filogenéticas e caracterização taxonômica das mesmas. Tais informações potencializam a futura utilização destas espécies em estudos ecológicos, morfológicos e fisiológicos. Assim, como resultado direto da presente proposta, esperamos publicar 12 artigos em revista com importante impacto na área de Biodiversidade. Indiretamente, nossa proposta também gerará mais publicações, pois todo o material coletado das outras famílias de insetos será destinado à especialistas ou depositado em museus para futuros estudos. Os dados gerados de associação com recursos tróficos também podem subsidiar novas publicações, não previstas inicialmente como resultado direto do projeto.

Relevância e impacto do projeto para o desenvolvimento científico, tecnológico ou de inovação:
Além das publicações elencadas anteriormente, o presente projeto possibilitará a formação e desenvolvimento técnico-científico de alunos de graduação e pós-graduação. Atualmente, o proponente coorienta três acadêmicos em doutoramento (Robson Crepes Corrêa - PPG Biologia Animal/UFRGS, Lucas Baptista Duarte - PPG Biologia Animal/ UFRGS e Luana Amaral dos Santos - PPG Entomologia/UFPR), um mestrando no PPG Biologia Animal/UFRGS (Marcos Henrique Frech Telles) e duas acadêmicas de iniciação científica vinculadas ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas/UFPel (Bibiana Luizi Groff e Jessyca Siemionko de Antoni). Ao longo dos próximos 48 meses, o proponente deverá encerrar as orientações em andamento e tem uma estimativa de que vai abrir 10 novas vagas para orientação, entre estudantes da graduação e pós-graduação.