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Com o envelhecimento, há progressiva perda da integridade fisiológica celular (López-Otín 2013) gerando uma ineficiência da homeostase metabólica (Salminen 2012). Como consequência, há um aumento do desenvolvimento de patologias relacionadas ao envelhecimento, como, câncer, diabetes, distúrbios cardiovasculares e doenças neurodegenerativas. Estes processos relacionados ao envelhecimento estão vinculados a via mTOR (Weichhart 2018), que quando ativada inibe a autofagia, ou seja, não há degradação ou recuperação de componentes celulares danificadas (Harrison 2009). Além do mais, nas fêmeas com o envelhecimento há depleção da reserva ovariana, resultando em redução da fertilidade, pela redução da quantidade e qualidade dos folículos ovarianos (Amanvermez 2016, Broekmans 2009). Neste sentido, a via mTOR também é importante, pois regula a depleção da reserva ovariana [ref].
Para minimizar os danos que o envelhecimento causa no organism e prolongar a fertilidade. A restrição calórica (RC) é uma intervenção, na qual há limitação da ingesta alimentar (Hernández-Saavedra 2019). Pois, se mostra capaz de minimizar ou retardar os efeitos do envelhecimento no metabolismo, como redução do ganho de peso e gordura visceral (Liu 2015, Mitchell 2016) e manutenção da sensibilidade à insulina (Mitchell 2016). Além disso, regula negativamente os genes envolvidos no estresse oxidativo, reduzindo o dano oxidativo (Heilbronn 2003). Por fim, a RC é capaz de retardar a depleção da reserva ovariana, pois inibe a ativação da via mTOR (Liu 2020, Garcia 2019).
No estilo de vida atual, as mulheres vêm adiando a maternidade, consequentemente apresentando maior dificuldade de engravidar e propensão do feto apresentar alguma mutação cromossômica. Apesar disso, são bastante escassos e dispersos os resultados encontrados na literatura com relação aos níveis de RC e idades de início dos tratamentos. Nossa proposta visa esclarecer quais efeitos que a RC pode impactar em diferentes idades de início do tratamento e se esses efeitos persistem após o retorno a uma dieta ad libitum. Surpreendentemente, não há na literatura informações sobre esses efeitos. Além do mais, preservar a reserva ovariana não se remete somente a manter a fertilidade em mulheres, mas também retardar a menopausa que está relacionada a diferentes doenças crônicas.

Animais e coleta de amostras
Para o experimento será utilizado camundongos fêmeas (n=110) da linhagem C57BL/6 com idade de 3 e 7 meses serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Os camundongos serão divididos em quatro grupos: controle jovem (n=50), RC jovem (n=50) e RC envelhecido (n=10). Todos os animais serão alimentados com ração padrão para roedores e água. Os grupos RC receberão uma quantidade 30% menor do que a média do grupo controle, que será ajustada diariamente, sendo de 10% na primeira semana, 20% na segunda semana e 30% da terceira semana em diante. Os tratamentos terão uma duração de 4 meses. Os dados de consumo da ração serão coletados todos os dias e de peso corporal serão coletados uma vez na semana. Ao final do período de RC os animais envelhecidos serão sincronizados com injeções de eCG e hCG e eutanasiados, assim como 10 animais de cada grupo jovem (controle e RC então com 7 meses de idade). O restante dos animais jovens voltará a receber alimentação ad libitum e será eutanasiada sequencialmente aos 8 (n=10/grupo), 9 (n=10/grupo), 10 (n=10/grupo) e 11 (n=10/grupo) meses de idade. Desta maneira poderemos observar por quantos meses o efeito da RC na reserva ovariana pode ser observado após o retorno a alimentação ad libitum. Ainda poderemos avaliar como a RC entre 3 e 7 meses de idade se compara com o efeito da RC entre 7 e 11 meses de idade. Podendo assim determinar se a RC em uma idade jovem terá efeitos de longo prazo na reserva, comparáveis quando iniciados em animais mais velhos. Os animais serão anestesiados por via inalatória com isofluorano e após será feita exsanguinação por punção cardíaca seguida de deslocamento cervical. Após a punção cardíaca a amostra retirada de sangue total que será centrifugada e o soro armazenado a – 80ºC. Os camundongos serão dissecados e um ovário do par será coletado e estocado a – 80ºC e outro em solução de paraformaldeido a 4%.
Análises laboratoriais das amostras
Dosagens Hormonais
O sangue coletado será centrifugado a 2.500 xg por 20 minutos e o soro separado e estocado a -80ºC até o momento das dosagens hormonais. As concentrações séricas de estradiol e progesterona serão determinadas por eletroquimioluminescencia em laboratório comercial.
Metabolismo da glicose
A sensibilidade periférica à insulina e função de células beta-pancreáticas serão avaliados a partir dos testes de tolerância à insulina (TTI). O TTI será realizado 7 dias antes da eutanásia, também com todos animais do experimento, onde após 2 horas de jejum, os animais receberão uma injeção intraperitoneal de insulina (0,5UI/kg de peso corporal) e terão sua glicemia monitorada nos tempos de 0, 15, 30 e 60. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda dos animais mensurando os níveis de glicose sérica pelo uso de um glicosímetro (AccuChek Active, Roche Diagnostics®, USA) TTG (FANG et al. 2013).
Contagem de folículos ovarianos
Para avaliação histológica, as amostras ovarianas serão retiradas do paraformaldeído e submetidas à desidratação em álcool, clareados em xilol e incluídos em Paraplast Plus (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Posteriormente, os ovários já incluídos em Paraplast Plus serão sequencialmente cortados em micrótomo automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK) em uma espessura de 5 μm, sendo que 1 a cada 6 cortes serão retirados e colocados em lâminas histológicas padrão. Além disso, cortes intermediários também serão separados para análise de imunofluorescência, usando lâminas silanadas em etanol com organosilano 3% (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Com isso feito e após a secagem das lâminas em estufa a 55°C, as mesmas serão coradas com hematoxilina-eosina, montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). Com a finalidade de avaliar a reserva ovariana em si, serão realizadas imagens de seções ovarianas capturadas por câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio (Nikon Eclipse E200, Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X. A classificação dos folículos ovarianos será determinada da seguinte forma: primordiais quando cercados por uma camada de células da granulosa achatadas; primários quando cercados por uma camada de células da granulosa cubóides; secundários quando rodeados por duas ou mais camadas de células da granulosa cubóides; terciários quando a presença de antro e complexo cumulus oophorus for observada (MYERS et al. 2004). Ainda por fim, a quantidade total de folículos encontrada será multiplicada por seis e posteriormente novamente multiplicada por dois, a fim de mimetizar a quantidade de folículos dos dois ovários.
Imunofluorescência
Após a desparafinização das amostras com xilol e reidratadas em concentrações de álcoois gradativas, será realizado o protocolo para imunofluorescência. Nesse sentindo, serão utilizados os anticorpos monoclonais primários para mTORC1 fosforilada e não fosforilada e FOXO3 fosforilada e não fosforilada, diluídos conforme a padronização de cada anticorpo. O procedimento de imunofluorescência será ajustado de acordo com o descrito anteriormente por nosso grupo (SACCON et al. 2017). Para análise, será utilizado de imagens dos folículos primordiais, primários e secundários capturadas com câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio confocal (Olympus FluoViewTM 1000), sendo posteriormente utilizado de 5 oócitos/animal/classe de folículo por grupo para gerar as médias. Os valores mais comuns, (a moda) de cada área, será registrada pelo aplicativo histograma 32-bit do software Image J®, utilizando uma escala que varia de 0 (a maior intensidade de coloração) a 255 (sem coloração) para as células da granulosa e para os oócitos.
Expressão gênica
Os ovários congelados serão transferidos para microtubos contendo 1mL de isotiocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA), sendo homogeneizado e armazenado à -70°C. O RNA total será quantificado por meio do uso do espectofotômetro (NanoDrop Lite, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), ajustando as amostras para 200 ng /µL. Ainda, as amostras terão sua pureza verificada através da taxa de absorbância de 260/280 nm. O DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de e 1 μg de RNA total utilizando do kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), gerando o volume total de 20 µL, conforme as recomendações do fabricante. A PCR em tempo real será realizada em duplicata, usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RTPCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sendo corridos 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação para cada ensaio, garantindo a amplificação de um único produto de PCR. Os genes usados para controle endógeno serão os genes beta-2 microglobulin (B2m) e actin beta (Actb) enquanto os genes alvos serão: RAC-alpha serine/threonine protein kinase 1 (Akt1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1 (Pik3r1), mechanistic target of rapamycin kinase (Mtor), forkhead box protein O3(Foxo3a), growth differentiation factor 9 (Gdf9), anti-Mullerian hormone (Amh), bone morphogenetic protein 15 (Bmp15), proto-oncogene receptor tyrosine kinase (Kit), Kit Ligand (Kitl), phosphatase and tensin homolog (Pten).
Para cálculo da expressão relativa de cada gene será utilizado do cálculo equação 2A-B/2C-D, onde o valor de A é o valor limiar do ciclo [CT] para o gene de interesse na primeira amostra do controle; B, o valor de Ct para o gene de interesse na amostra analisada; C, a média geométrica dos valores Ct para os genes B2M e ACTB na primeira amostra do controle e D, a média do Ct para os genes B2m e ACTB na amostra analisada.
Análises Estatísticas
As análises estatísticas serão realizadas utilizando o software Graphpad Prism 8.0. O teste estatístico One Way ANOVA será utilizado para as análises de variáveis contínuas (EROs, contagem de folículos e expressão gênica), utilizado o teste ANOVA de medidas repetidas para a análise do consumo, peso corporal, TTI e TTG. Quando significativo, o teste de t foi utilizado para comparar as médias individuais. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Este projeto tem como objetivo testar os efeitos da restrição dietética em diferentes idades sobre o envelhecimento ovariano. Poucos grupos brasileiros têm trabalhado nesta temática do envelhecimento que se mostra tão importante atualmente e, portanto, a consolidação de centros de pesquisa na nossa região se torna fundamental. Esta temática é cada vez mais importante, visto que a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade, particularmente importantes em mulheres pós- menopausa, quando sua incidência aumenta drasticamente. Acreditamos que esta série de experimentos que se inicia nos permitirá melhor entender o processo de envelhecimento ovariano favorecendo a saúde da mulher, especialmente em períodos sensíveis com relação a queda da fertilidade e estabelecimento da menopausa e no futuro desenvolver estratégias de intervenção visando prevenir a queda da fertilidade. A meta é a formação de 1 mestre e publicação de um artigo cientifico em periódico internacional.