Nome do Projeto
Efeitos da restrição calórica e persistência do seu efeito na preservação da fertilidade em diferentes faixas etárias de camundongos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
05/06/2023 - 05/06/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
Muito antes da exaustão da reserva ovariana, há redução da qualidade da fertilidade. Isto porque, a reserva ovariana é estabelecida intrauterinamente e declina ao longo da vida. A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética com efeito promotor da preservação da reserva ovariana, devido ao controle do estresse oxidativo, status inflamatório e regulação de vias como a mTOR e FOXO3. Assim, o objetivo do presente estudo é entender como a dieta, o envelhecimento e a fertilidade feminina interagem. Da mesma maneira, entender o efeito da RC quando iniciada numa idade jovem ou mais avançada e sua persistência frente a reserva ovariana. Neste estudo serão utilizados camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 de 3 e 7 meses de idade. Sendo submetidos à RC de 30% os camundongos velhos durante todo experimento, já os camundongos jovens retornarão à alimentação ad libitum após 4 meses de tratamento. A partir disso, será avaliado os ovários quanto ao número de folículos. Será realizada a imunofluorescência e expressão de genes relacionados a sinalização para mTOR e FOXO3. Visto que, cada vez mais mulheres optam por conceber em idades mais avançadas, com declínio da fertilidade, espera-se que a RC reduza esta perda da reserva folicular ovariano e os danos em sua qualidade.

Objetivo Geral

O objetivo geral desta proposta é avaliar os efeitos da RC em diferentes fases da vida da fêmea sobre o envelhecimento ovariano. Como objetivos específicos, visamos 1) entender o efeito da RC de 30% em fêmeas jovens e envelhecidas; e 2) a persistência do efeito da RC após o retorno a alimentação ad libitum.

Justificativa

Com o envelhecimento, há progressiva perda da integridade fisiológica celular (López-Otín 2013) gerando uma ineficiência da homeostase metabólica (Salminen 2012). Como consequência, há um aumento do desenvolvimento de patologias relacionadas ao envelhecimento, como, câncer, diabetes, distúrbios cardiovasculares e doenças neurodegenerativas. Estes processos relacionados ao envelhecimento estão vinculados a via mTOR (Weichhart 2018), que quando ativada inibe a autofagia, ou seja, não há degradação ou recuperação de componentes celulares danificadas (Harrison 2009). Além do mais, nas fêmeas com o envelhecimento há depleção da reserva ovariana, resultando em redução da fertilidade, pela redução da quantidade e qualidade dos folículos ovarianos (Amanvermez 2016, Broekmans 2009). Neste sentido, a via mTOR também é importante, pois regula a depleção da reserva ovariana [ref].
Para minimizar os danos que o envelhecimento causa no organism e prolongar a fertilidade. A restrição calórica (RC) é uma intervenção, na qual há limitação da ingesta alimentar (Hernández-Saavedra 2019). Pois, se mostra capaz de minimizar ou retardar os efeitos do envelhecimento no metabolismo, como redução do ganho de peso e gordura visceral (Liu 2015, Mitchell 2016) e manutenção da sensibilidade à insulina (Mitchell 2016). Além disso, regula negativamente os genes envolvidos no estresse oxidativo, reduzindo o dano oxidativo (Heilbronn 2003). Por fim, a RC é capaz de retardar a depleção da reserva ovariana, pois inibe a ativação da via mTOR (Liu 2020, Garcia 2019).
No estilo de vida atual, as mulheres vêm adiando a maternidade, consequentemente apresentando maior dificuldade de engravidar e propensão do feto apresentar alguma mutação cromossômica. Apesar disso, são bastante escassos e dispersos os resultados encontrados na literatura com relação aos níveis de RC e idades de início dos tratamentos. Nossa proposta visa esclarecer quais efeitos que a RC pode impactar em diferentes idades de início do tratamento e se esses efeitos persistem após o retorno a uma dieta ad libitum. Surpreendentemente, não há na literatura informações sobre esses efeitos. Além do mais, preservar a reserva ovariana não se remete somente a manter a fertilidade em mulheres, mas também retardar a menopausa que está relacionada a diferentes doenças crônicas.

Metodologia

Animais e coleta de amostras
Para o experimento será utilizado camundongos fêmeas (n=110) da linhagem C57BL/6 com idade de 3 e 7 meses serão mantidos em condições controladas de temperatura, luz e umidade (22 ± 2 ºC, ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro e 40%-60%). Os camundongos serão divididos em quatro grupos: controle jovem (n=50), RC jovem (n=50) e RC envelhecido (n=10). Todos os animais serão alimentados com ração padrão para roedores e água. Os grupos RC receberão uma quantidade 30% menor do que a média do grupo controle, que será ajustada diariamente, sendo de 10% na primeira semana, 20% na segunda semana e 30% da terceira semana em diante. Os tratamentos terão uma duração de 4 meses. Os dados de consumo da ração serão coletados todos os dias e de peso corporal serão coletados uma vez na semana. Ao final do período de RC os animais envelhecidos serão sincronizados com injeções de eCG e hCG e eutanasiados, assim como 10 animais de cada grupo jovem (controle e RC então com 7 meses de idade). O restante dos animais jovens voltará a receber alimentação ad libitum e será eutanasiada sequencialmente aos 8 (n=10/grupo), 9 (n=10/grupo), 10 (n=10/grupo) e 11 (n=10/grupo) meses de idade. Desta maneira poderemos observar por quantos meses o efeito da RC na reserva ovariana pode ser observado após o retorno a alimentação ad libitum. Ainda poderemos avaliar como a RC entre 3 e 7 meses de idade se compara com o efeito da RC entre 7 e 11 meses de idade. Podendo assim determinar se a RC em uma idade jovem terá efeitos de longo prazo na reserva, comparáveis quando iniciados em animais mais velhos. Os animais serão anestesiados por via inalatória com isofluorano e após será feita exsanguinação por punção cardíaca seguida de deslocamento cervical. Após a punção cardíaca a amostra retirada de sangue total que será centrifugada e o soro armazenado a – 80ºC. Os camundongos serão dissecados e um ovário do par será coletado e estocado a – 80ºC e outro em solução de paraformaldeido a 4%.
Análises laboratoriais das amostras
Dosagens Hormonais
O sangue coletado será centrifugado a 2.500 xg por 20 minutos e o soro separado e estocado a -80ºC até o momento das dosagens hormonais. As concentrações séricas de estradiol e progesterona serão determinadas por eletroquimioluminescencia em laboratório comercial.
Metabolismo da glicose
A sensibilidade periférica à insulina e função de células beta-pancreáticas serão avaliados a partir dos testes de tolerância à insulina (TTI). O TTI será realizado 7 dias antes da eutanásia, também com todos animais do experimento, onde após 2 horas de jejum, os animais receberão uma injeção intraperitoneal de insulina (0,5UI/kg de peso corporal) e terão sua glicemia monitorada nos tempos de 0, 15, 30 e 60. O sangue será coletado através de uma pequena incisão na ponta da cauda dos animais mensurando os níveis de glicose sérica pelo uso de um glicosímetro (AccuChek Active, Roche Diagnostics®, USA) TTG (FANG et al. 2013).
Contagem de folículos ovarianos
Para avaliação histológica, as amostras ovarianas serão retiradas do paraformaldeído e submetidas à desidratação em álcool, clareados em xilol e incluídos em Paraplast Plus (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Posteriormente, os ovários já incluídos em Paraplast Plus serão sequencialmente cortados em micrótomo automático Leica modelo RM2245 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK) em uma espessura de 5 μm, sendo que 1 a cada 6 cortes serão retirados e colocados em lâminas histológicas padrão. Além disso, cortes intermediários também serão separados para análise de imunofluorescência, usando lâminas silanadas em etanol com organosilano 3% (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, USA). Com isso feito e após a secagem das lâminas em estufa a 55°C, as mesmas serão coradas com hematoxilina-eosina, montadas com lamínulas e resina sintética (Sigma Chemical Company®, St. Louis, MO, EUA). Com a finalidade de avaliar a reserva ovariana em si, serão realizadas imagens de seções ovarianas capturadas por câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio (Nikon Eclipse E200, Nikon Corporation, Japan), utilizando objetivas de 10 e 40X. A classificação dos folículos ovarianos será determinada da seguinte forma: primordiais quando cercados por uma camada de células da granulosa achatadas; primários quando cercados por uma camada de células da granulosa cubóides; secundários quando rodeados por duas ou mais camadas de células da granulosa cubóides; terciários quando a presença de antro e complexo cumulus oophorus for observada (MYERS et al. 2004). Ainda por fim, a quantidade total de folículos encontrada será multiplicada por seis e posteriormente novamente multiplicada por dois, a fim de mimetizar a quantidade de folículos dos dois ovários.
Imunofluorescência
Após a desparafinização das amostras com xilol e reidratadas em concentrações de álcoois gradativas, será realizado o protocolo para imunofluorescência. Nesse sentindo, serão utilizados os anticorpos monoclonais primários para mTORC1 fosforilada e não fosforilada e FOXO3 fosforilada e não fosforilada, diluídos conforme a padronização de cada anticorpo. O procedimento de imunofluorescência será ajustado de acordo com o descrito anteriormente por nosso grupo (SACCON et al. 2017). Para análise, será utilizado de imagens dos folículos primordiais, primários e secundários capturadas com câmera digital (Moticam 5.0, Motic®, Hong Kong, China) acoplada em microscópio confocal (Olympus FluoViewTM 1000), sendo posteriormente utilizado de 5 oócitos/animal/classe de folículo por grupo para gerar as médias. Os valores mais comuns, (a moda) de cada área, será registrada pelo aplicativo histograma 32-bit do software Image J®, utilizando uma escala que varia de 0 (a maior intensidade de coloração) a 255 (sem coloração) para as células da granulosa e para os oócitos.
Expressão gênica
Os ovários congelados serão transferidos para microtubos contendo 1mL de isotiocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA), sendo homogeneizado e armazenado à -70°C. O RNA total será quantificado por meio do uso do espectofotômetro (NanoDrop Lite, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), ajustando as amostras para 200 ng /µL. Ainda, as amostras terão sua pureza verificada através da taxa de absorbância de 260/280 nm. O DNA complementar (cDNA) será sintetizado a partir de e 1 μg de RNA total utilizando do kit comercial (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA), gerando o volume total de 20 µL, conforme as recomendações do fabricante. A PCR em tempo real será realizada em duplicata, usando GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) no equipamento StepOne 7500 RTPCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sendo corridos 45 ciclos (95°C durante 15s e 60 °C durante 60s) e uma curva de dissociação para cada ensaio, garantindo a amplificação de um único produto de PCR. Os genes usados para controle endógeno serão os genes beta-2 microglobulin (B2m) e actin beta (Actb) enquanto os genes alvos serão: RAC-alpha serine/threonine protein kinase 1 (Akt1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1 (Pik3r1), mechanistic target of rapamycin kinase (Mtor), forkhead box protein O3(Foxo3a), growth differentiation factor 9 (Gdf9), anti-Mullerian hormone (Amh), bone morphogenetic protein 15 (Bmp15), proto-oncogene receptor tyrosine kinase (Kit), Kit Ligand (Kitl), phosphatase and tensin homolog (Pten).
Para cálculo da expressão relativa de cada gene será utilizado do cálculo equação 2A-B/2C-D, onde o valor de A é o valor limiar do ciclo [CT] para o gene de interesse na primeira amostra do controle; B, o valor de Ct para o gene de interesse na amostra analisada; C, a média geométrica dos valores Ct para os genes B2M e ACTB na primeira amostra do controle e D, a média do Ct para os genes B2m e ACTB na amostra analisada.
Análises Estatísticas
As análises estatísticas serão realizadas utilizando o software Graphpad Prism 8.0. O teste estatístico One Way ANOVA será utilizado para as análises de variáveis contínuas (EROs, contagem de folículos e expressão gênica), utilizado o teste ANOVA de medidas repetidas para a análise do consumo, peso corporal, TTI e TTG. Quando significativo, o teste de t foi utilizado para comparar as médias individuais. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Indicadores, Metas e Resultados

Este projeto tem como objetivo testar os efeitos da restrição dietética em diferentes idades sobre o envelhecimento ovariano. Poucos grupos brasileiros têm trabalhado nesta temática do envelhecimento que se mostra tão importante atualmente e, portanto, a consolidação de centros de pesquisa na nossa região se torna fundamental. Esta temática é cada vez mais importante, visto que a expectativa de vida da população vem aumentando nos últimos e com isso a incidência de diversos tipos de enfermidades ligadas a idade, particularmente importantes em mulheres pós- menopausa, quando sua incidência aumenta drasticamente. Acreditamos que esta série de experimentos que se inicia nos permitirá melhor entender o processo de envelhecimento ovariano favorecendo a saúde da mulher, especialmente em períodos sensíveis com relação a queda da fertilidade e estabelecimento da menopausa e no futuro desenvolver estratégias de intervenção visando prevenir a queda da fertilidade. A meta é a formação de 1 mestre e publicação de um artigo cientifico em periódico internacional.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AUGUSTO SCHNEIDER2
BIANCA MACHADO DE AVILA
BIANKA MACHADO ZANINI
CAMILA LAPISCHIES MOREIRA
CARLOS CASTILHO DE BARROS2
CESAR AUGUSTO PINZON OSORIO
DRIELE NESKE GARCIA
EDIANA VÖLZ NEITZKE KARNOPP
FABÍOLA DA SILVA RODRIGUES
GABRIELA ALTMAYER BLANCO
JULIANE BRISTOT PROSCZEK
JÉSSICA DAMÉ HENSE
MARIANA MACHADO BARRETO
RENATA PEREIRA RAMIREZ2

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 5.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 5.000,00

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