Portal InstitucionalUFPEL

Diabetes Mellitus, doença de difícil controle através dos tratamentos disponíveis, é um dos mais importantes problemas de saúde pública mundial, cuja prevalência cresce a cada ano. A Organização Mundial de Saúde prevê que 439 milhões de pessoas terão a doença em 2030, embora em 2014, 387 milhões de pessoas já tenham sido diagnosticadas com diabetes de acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF, 2015). Esta doença é caracterizada por ser um distúrbio metabólico complexo resultante de comprometimento progressivo da secreção de insulina e resistência à insulina (KARUNAKARAN & PARK, 2013). Caracteriza-se por hiperglicemia crônica com distúrbios no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas. Pode ser classificada em diabetes tipo 1, resultante da destruição auto-imune ou idiopática das células beta, ou em diabetes tipo 2, caracterizada por alterações na resposta celular à insulina em tecidos alvo, como músculo e tecido adiposo, e/ou defeitos secretórios nas células beta (B) (DANEMAN, 2006).

O desenvolvimento das complicações da diabetes está intimamente relacionado ao aumento do estresse oxidativo, que está associado a um desequilíbrio no balanço de antioxidantes e pró-oxidantes, em favor dos pró-oxidantes (SIES, 1985). Evidências consideráveis sugerem que a elevação crônica da glicose conduz à geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), o que resulta em aumento do estresse oxidativo das células-B (REHMAN et al., 1999; MOHAMED et al., 1999). Como resultado, o estresse oxidativo das células-B influenciam tanto na secreção de insulina quanto na ação, devido à sua capacidade para danificar diretamente e oxidar DNA, proteínas e lipídios. Além dos prejuízos macromoleculares, EROs podem ativar uma série de vias sensíveis ao estresse celular que têm sido associadas à resistência à insulina e à diminuição da secreção de insulina (EVANS et al., 2002).

Muitos estudos sugerem que a exposição crônica de células-B a elevados níveis de glicose pode contribuir para a disfunção das células β (LEROITH et al., 2000), resultando no aumento do fluxo glicolítico e subsequente produção de equivalentes redutores que conduzem à produção de EROs, incluindo radical ânion superóxido (O2∙−), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidrolixa (OH), os quais podem ser dismutados. O radical superóxido (O2∙−) pode ser convertido em H2O2 pela enzima superóxido dismutase (SOD) mitocondrial, e após pode ser convertido em água (H2O) e oxigênio (O2) pelas enzimas glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT) (KARUNAKARAN & PARK, 2013). Experimentalmente, tem-se utilizado como modelo de diabetes, a indução desta pela estreptozotocina, um agente diabetogênico que provoca uma destruição em cerca de 85% das células-B e aumento das EROs. A ação da estreptozotocina em camundongos se assemelha com a fisiopatologia e progressão da doença em humanos, sendo assim um modelo bastante usado para diabetes tipo 1 (KAVALALI et al., 2002; ZHANG & TAN, 2000).

A fim de neutralizar EROs, as células são equipadas com mecanismos de defesa antioxidantes capazes de combater o estresse oxidativo. Em comparação com outros tecidos, células-B têm uma baixa concentração de enzimas de defesa antioxidantes, tais como CAT, GPx e SOD (LENZEN et al., 1996; GRANKVIST et al., 1981). Assim, devido ao baixo nível de defesa antioxidante nas ilhotas, o excesso de EROs leva ao estresse oxidativo durante a disfunção das células-B. Porém, a administração de substâncias antioxidantes pode aumentar a capacidade de defesa das células (PI et al., 2006; KANETO et al., 1996). No contexto de substâncias antioxidantes, alguns probióticos já foram relacionados como adjuvantes eficazes na terapia de resistência à insulina (GOMES et al., 2014).

Probióticos são micro-organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002), como a atividade antioxidante (GOMES et al., 2014; PARK et al., 2013; YADAV et al., 2008) ou a atuação na prevenção e/ou tratamento adjuvante de doenças relacionadas ao estresse oxidativo, como a diabetes.

Bacillus cereus var. Toyoi, uma variedade de Bacillus cereus isolada do solo (WILLIAMS et al., 2009), não é patogênico, não produz toxinas e não transmite resistência a antibióticos. Estudos têm demonstrado que a bactéria probiótica B. Toyoi é capaz de promover ganho de peso e controle de diarréias em animais (COPPOLA & TURNES, 2004), melhorar a conversão alimentar (WILLIAMS et al., 2009) e reduzir a prevalência de salmonelas em aves (VILÀ et al., 2009).

Saccharomyces boulardii é um probiótico com ação bioterapêutica benéfica, que desempenha um papel na prevenção e/ou tratamento de várias doenças, e que é seguro para uso em humanos (ALGIN et al., 2005; BARBOSA, et al., 2011; VILLAR-GARCÍA et al., 2015) e em camundongos (ALGIN et al., 2005; FILHO et al., 1998; GENEROSO et al., 2010; VILLAR-GARCIA et al., 2015). Grande parte dos estudos encontrados na literatura mostram que S. boulardii é eficaz na prevenção e tratamento da diarreia associada ao uso de antibióticos (CZERUCKA et al., 2007; COLLIGNON et al., 2010; MCFARLANT, 2010) e diarreia do viajante (LOPES & PINTO, 2010; MCFARLANT, 2010; WYK, 2015). Entretanto, também já foi associado à redução da permeabilidade intestinal e da translocação bacteriana (GENEROSO et al., 2010; VILLAR-GARCIA et al.,2015) e à melhora na função imunológica (SAAD, 2006; MCFARLAND, 2010).

Komagataella pastoris (anteriormente conhecida como Pichia pastoris) é uma levedura da família Saccharomycetaceae, gênero Komagataella, que pode ser utilizada na produção de proteínas recombinantes em larga escala (STORCH, 2008; STORCH, 2008; DUMMER et al., 2009 a; DUMMER et al., 2009 b; NIZOLI et al., 2009; KLAFKE et al., 2016; SIEDLER et al., 2017). Também se distingue pela sua capacidade de crescimento a partir de resíduos de baixo custo e meios de cultura relativamente simples, possibilitando sua produção em larga escala industrial (CREGG, 2017). Estudos prévios, realizados na Universidade Federal de Pelotas (UFPel), tem avaliado o potencial probiótico de K. pastoris. Gil de Los Santos et al. (2012) observaram que K. pastoris e sua variante recombinante melhoraram a conversão alimentar e aumentaram significativamente o ganho de peso e a soroconversão contra C. perfringens de frangos de corte, sem causar alterações histopatológicas significativas. França et. al. (2015) encontraram potencial efeito antimicrobiano de K. pastoris ao desafiarem camundongos Balb/c suplementados com a levedura contra Salmonella Typhimurium e observarem proteção, indicando que esta levedura além de possuir facilidade de manipulação genética, apresenta-se como um portador de moléculas biofuncionais em alimentos para animais. Além disso, concluíram que esta levedura é inócua, e é capaz de resistir à passagem através do trato gastrointestinal (TGI) de mamíferos e de inibir o crescimento de S. Typhimurium in vitro. E no intuito de explorar mais os potenciais efeitos probióticos desta levedura, Cunha (2016) realizou estudos adicionais avaliando a variação de peso, as contagens de leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos, a peroxidação lipídica avaliada por TBARS e a segurança da utilização de K. pastoris em camundongos Swiss imunossuprimidos. A levedura possuiu efeito protetor à hepatotoxicidade causada pela aplicação da CF, estimulou o ganho de peso, protegeu os animais da leucopenia e neutropenia decorrentes da administração deste fármaco, uma vez que foi capaz de aumentar significativamente o número de células dos animais saudáveis e submetidos ao tratamento quimioterápico, e reduziu os níveis de TBARS no rim e cérebro dos animais tratados com CF e no fígado e cérebro de animais saudáveis.

Com base nas problemáticas apresentadas, existe a necessidade de desenvolver novas abordagens para a prevenção e o tratamento adjuvante da diabetes com impacto social de tamanha importância. Diante disso, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito de formulações contendo os probióticos B. Toyoi, S. boulardiie K. pastoris na prevenção e/ou tratamento adjuvante da diabetes, através da avaliação da sua ação sob biomarcadores bioquímicos e de estresse oxidativo em camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina.

Probióticos e condições de cultivo

Os micro-organismos B. Toyoi, S. boulardii e K. pastoris que serão utilizados nesse trabalho serão provenientes do banco de micro-organismos do Núcleo de Biotecnologia (CDTec-UFPel). A bactéria B. Toyoi liofilizada será suspensa em solução salina estéril, semeada em placas contendo Ágar Sangue e as placas incubadas por 24 h à 37ºC. A seguir, 50 μL de uma suspensão contendo 3 a 5 colônias serão adicionados a 70 mL de caldo Infusão de cérebro e coração (BHI) e o cultivo será incubado em agitador orbital a 200 rpm, por 37ºC por 16 a 18 h. Após, 70 mL do inóculo serão adicionados a 700 mL de caldo NYSM (YOUSTEN, 1984) e o cultivo será incubado a 37°C sob agitação de 200 rpm durante 24 h. A suspensão será aquecida em banho-maria a 80ºC durante 15 minutos para eliminar formas vegetativas do bacilo. O cultivo será centrifugado a 4000 g por 15 minutos, sob refrigeração de 4ºC, e concentrado a um volume de 700 mL. A concentração de B. Toyoi será determinada através da diluição em série decimal do cultivo em solução salina (NaCl 0,9%) estéril e da contagem das UFCs.mL-1 em placas contendo Agar BHI, após a incubação das mesmas a 37º C por 24 h.

S. boulardii e K. pastoris liofilizadas serão ressuspensas em solução salina, semeadas em placas contendo Ágar Levedura, Peptona e Dextrose (YPD) e as placas incubadas por 42 h à 28ºC. A seguir, 50 μL de uma suspensão contendo 3 a 5 colônias de cada levedura serão adicionados a 70 mL de caldo YPD e os cultivos serão incubados em agitador orbital a 200 rpm, a 28ºC, por aproximadamente 24 h. Após, 70 mL dos inóculos serão adicionados a 700 mL de caldo YPD e os cultivos serão incubados a 28°C sob agitação de 200 rpm durante 24h. As concentrações de S. boulardii e de K. pastoris serão determinadas através de diluição decimal em solução salina (NaCl 0,9%) estéril e contagem em placas contendo Agar YPD (em UFC. mL-1).

Animais e delineamento do estudo

Os ensaios biológicos serão desenvolvidos no Biotério Central ou no Biotério da Nutrição da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Os animais com 45 dias de idade, procedentes do Biotério Central da UFPel, serão mantidos em gaiolas apropriadas de 30 X 20 X 13 cm, contendo 5 camundongos por gaiola, em ambiente com temperatura de 22-24ºC e umidade relativa de 65-75%, e com ciclos de luz e escuridão de 12 h. Todos os animais receberão dieta padrão para roedores e água esterilizada ad libitum.

Como os efeitos de probióticos são cepa-específicos, serão avaliadas formulações contendo os três probióticos (B. Toyoi, S. boulardii e K. pastoris), um de cada vez. Para a avaliação de cada formulação contendo um probiótico na prevenção e/ou tratamento adjuvante da diabetes, através da avaliação da sua ação sob biomarcadores bioquímicos e de estresse oxidativoem camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina, serão utilizados camundongos Swiss, divididos randomicamente em quatro grupos, da seguinte forma:

1) Grupo controle: não será suplementado com probiótico e não sofrerá indução da diabetes;

2) Grupo probiótico: será suplementado diariamente com a formulação contendo 108 CFU.mL-1 do probiótico por gavagem e não sofrerá indução da diabetes;

3) Grupo estreptozotocina: não será suplementado com probiótico e a diabetes será induzida por estreptozotocina;

4) Grupo estreptozotocina + probiótico: será suplementado diariamente com a formulação contendo 108 CFU.mL-1 do probiótico por gavagem e sofrerá indução de diabetes.

A suplementação com a formulação contendo os probióticos começará 15 dias antes da indução do diabetes e continuará até o fim do estudo. No 16º dia após o início do tratamento com a formulação contendo o probiótico será iniciada a indução da diabetes, a qual ocorrerá por três dias consecutivos, com estreptozotocina (100 mg.kg-1 de peso) diluída em solução salina a 0,9%, via intraperitoneal (i.p). Segundo a resolução Normativa no 33, de 18 de novembro de 2016 do CONCEA, a via intraperitoneal é comumente usada em ratos e camundongos e não é necessária anestesia. Os camundongos tratados com estreptozotocina receberão solução de glicose a 5% diluída em água durante 24 h após a indução da diabetes, a fim de prevenir a morte por choque hiperglicêmico.

Para a avaliação da variação de peso, os animais serão pesados todos os dias. A média do consumo alimentar será avaliada através da subtração do peso da ração oferecida inicialmente aos grupos pela quantidade restante final, sendo determinada todos os dias. Para o cálculo do índice de conversão alimentar (ICA) por grupo nos períodos avaliados, será utilizada a equação: ICA = média de consumo alimentar/média de ganho de peso no período e, para obter-se o índice de eficiência alimentar (IEA) por grupo nos períodos, será utilizada a equação: IEA = média de ganho de peso/ média de consumo alimentar no período.

Três dias após o último dia de indução do diabetes (dia 19), amostras de sangue dos animais serão coletadas a partir da veia da cauda, para verificar a glicemia após 4 horas de jejum, a fim de confirmar a indução da diabetes. As medições serão realizadas com um glicosímetro digital Accu-Check Nano Performa. Animais com níveis de glicose no sangue superiores ou iguais a 250 mg.dl-1 serão considerados diabéticos. Após, será procedida a eutanásia através da exsanguinação por punção cardíaca após anestesia com isoflurano. Os animais serão colocados em caixas fechadas e expostos a algodão embebido em isoflurano. Após constatada a ausência de reflexos, será realizada a punção intracardíaca para exsanguinação e a coleta de sangue em tubos contendo heparina sódica. Se necessário, será realizado o deslocamento cervical para constatação da morte do animal. Todos os esforços serão realizados para diminuir o sofrimento dos animais. O procedimento será feito em sala especifica e isolada.

O plasma será obtido por centrifugação a 2000 g durante 10 min e utilizado para realizar as dosagens bioquímicas da aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), uréia, creatinina, colesterol total e frações, triglicerídeos e glicose. A análise bioquímica das amostras de plasma será realizada utilizando kits comerciais (Labtest, Minas Gerais, Brasil).

O fígado, um rim e o encéfalo serão rapidamente removidos em condições assépticas, pesados e homogeneizados em 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 (1/10, w / v). Os tecidos homogeneizados serão centrifugados a 4000 g durante 10 min a 4 ºC e o sobrenadante será utilizado para o ensaio das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e para a avaliação da atividade das enzimas antioxidantes CAT e SOD.

Os níveis de TBARS serão determinados como descrito por Ohkawa (1979) no fígado, rins e encéfalo. Um dos produtos finais da peroxidação lipídica, o malondialdeído (MDA), servirá como um índice da intensidade do estresse oxidativo. O nível de TBARS será medido espectrofotometricamente a 532 nm e expresso em nmol MDA.g-1 do tecido.

A atividade da enzima CAT envolve o consumo de peróxido de hidrogênio (H2O2) e será determinada através de um espectrofotômetro a 240 nm, de acordo com Aebi (1984). A atividade da enzima será expressa em unidades de U CAT.g-1 de proteína.

A atividade da enzima SOD baseia-se na dismutação do radical ânion superóxido com adrenalina, como descrito por Mishra e Fridovich (1972), e será detectada com um espectrofotômetro a 480 nm. A atividade da enzima será expressa em U.g-1 de proteína.

Todos os resultados serão expressos como média ± desvio padrão. Análise de Variância ANOVA de uma via, será realizada através do software GraphPad Prism 5.0 para determinar diferenças significativas (p < 0,05) entre as médias aritméticas.

Indicadores de resultados ao final do projeto:

- Desenvolvimento de formulações contendo os probióticos B. Toyoi, S. boulardii ou K. pastoris como medida profilática e/ou tratamento adjuvante do diabetes com efeito hipoglicemiante, por evitar o aumento e/ou diminuir os níveis de glicemia em um modelo de diabetes, utilizando camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina;

- Desenvolvimento de formulações contendo os probióticos B. Toyoi, S. boulardii ou K. pastoris como medida profilática e/ou tratamento adjuvante do diabetes com efeito(s) sobre outro(s) parâmetro(s) bioquímicos(s), em um modelo de diabetes, utilizando camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina;

- Desenvolvimento de formulações contendo os probióticos B. Toyoi, S. boulardii ou K. pastoris como medida profilática e/ou tratamento adjuvante do diabetes com efeito(s) antioxidante(s), por promover a redução na formação das espécies reativas e peroxidação lipídica nos rins, fígado e/ou encéfalo e o aumento da atividade da(s) enzima(s) antioxidante(s) CAT e/ou SOD no encéfalo, fígado e rins, em um modelo de diabetes, utilizando camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina.

- Formação de recursos humanos qualificados;

- Publicações em periódicos nacionais e internacionais indexados;

- Apresentação de trabalhos em congressos;

- Patentes.

Metas:

1º semestre: Ganho de peso corporal, consumo alimentar e conversão alimentar dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo B. Toyoi por gavagem avaliados. Estudantes treinados.

2º semestre: Parâmetros bioquímicos glicemia de jejum, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), triglicerídeos, colesterol total e frações, creatinina e uréia dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo B. Toyoi por gavagem avaliados. Estudantes treinados.

3º semestre: Parâmetros de estresse oxidativo, como peroxidação lipídica (determinação dos níveis de TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) no fígado, encéfalo e rins dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo B. Toyoi por gavagem avaliados. Resumos para eventos científicos, artigos científicos e patente redigidos e submetidos. Estudantes treinados.

4º semestre: Ganho de peso corporal, consumo alimentar e conversão alimentar dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo K. pastoris por gavagem avaliados. Estudantes treinados.

5º semestre: Parâmetros bioquímicos glicemia de jejum, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), triglicerídeos, colesterol total e frações, creatinina e uréia dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo K. pastoris por gavagem avaliados. Estudantes treinados.

6º semestre: Parâmetros de estresse oxidativo, como peroxidação lipídica (determinação dos níveis de TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) no fígado, encéfalo e rins dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo K. pastoris por gavagem avaliados. Resumos para eventos científicos, artigos científicos e patente redigidos e submetidos. Estudantes treinados.

7º semestre: Ganho de peso corporal, consumo alimentar e conversão alimentar dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo S. boulardii por gavagem avaliados. Estudantes treinados.

8º semestre: Parâmetros bioquímicos glicemia de jejum, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), triglicerídeos, colesterol total e frações, creatinina e uréia, e parâmetros de estresse oxidativo, como peroxidação lipídica (determinação dos níveis de TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) no fígado, encéfalo e rins dos camundongos Swiss com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados diariamente com a formulação contendo S. boulardii por gavagem avaliados. Resumos para eventos científicos, artigos científicos, patente e relatório final redigidos e submetidos. Estudantes treinados.

Resultados esperados:

Ao final do projeto espera-se que os camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina e suplementados com formulações contendo os probióticos B. Toyoi, S. boulardii e/ou K. pastoris apresentem melhora na hiperglicemia, nos parâmetros de estresse oxidativo e em outros parâmetros bioquímicos, ou seja, espera-se comprovar novos efeitos benéficos dos probióticos avaliados. Acredita-se que os resultados desse trabalho terão impacto positivo no manejo das complicações do diabetes, o que futuramente poderá impactar diretamente na saúde do paciente diabético, melhorando assim seu prognóstico e qualidade de vida.

Além disso, por existir o envolvimento de estudantes de graduação e pós-graduação no projeto, haverá a capacitação técnica de recursos humanos que estarão treinados para atuar nesta área no futuro e que servirão de difusores da tecnologia gerada. Os resultados obtidos serão publicados na forma de artigo(s) científico(s) em periódico(s) e apresentados em congressos nacionais e internacionais. Patentes serão depositadas.