Nome do Projeto
AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA SOBRE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS EM CULTURAS CELULARES PRIMÁRIAS DE ASTRÓCITOS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
12/12/2024 - 12/10/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Atualmente, apesar de já se terem inúmeros estudos que busquem elucidar os mecanismos e propor medidas terapêuticas mais efetivas para o tratamento de doenças que afetam o sistema nervosos central (SNC), ainda é necessária a procura por métodos de tratamento menos invasivos, com efeitos colaterais reduzidos, simplicidade e uma melhor capacidade de adesão. Por esse motivo, o desenvolvimento de novos protocolos que visam auxiliar esse processo de descoberta se faz interessante. A utilização de um modelo de cultivo celular de cultura primária de astrócitos submetidos a eletroestimulação transcraniana (ETCC) adaptada para a aplicação em células pode auxiliar na obtenção de informações muito úteis em relação a marcadores bioquímicos envolvidos nas diferentes patologias cerebrais. O estudo dessas mudanças primeiramente em células saudáveis, dá suporte para posteriormente a aplicação de doenças específicas e tratamento por ETCC, utilizando o cultivo celular como um método de triagem para que se possa delimitar uma pesquisa in vivo mais precisa e objetiva de com esse método de tratamento, auxiliando na redução do número de animais utilizados para experimento in vivo. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar os efeitos da estimulação elétrica em cultivo primário de astrócitos. Para isso, ratos Wistar neonato serão utilizados para obtenção do cultivo primário. Serão utilizadas placas de 12 poços onde as células serão semeadas e após atingirem a confluência serão submetidas a ETCC, sendo divididas em grupo controle (não sofre nenhum estímulo elétrico), grupo ETCC 5min (estimulação por 5 minutos); ETCC 15 min (estimulação por 15 minutos); ETCC 30 min (estimulação por 30 minutos) e ETCC 40 min (estimulação por 40 minutos). A estimulação ocorrerá por 7 dias consecutivos, sendo cada placa estimulada uma única vez ao dia. Após 24h do último dia de estimulação, serão realizados os ensaios bioquímicos e morfológicos. PALAVRAS-CHAVE: estresse oxidativo, astrócitos, ETCC, BDNF.
Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da estimulação elétrica em cultivo primário de astrócitos.
Justificativa
Este projeto busca analisar alterações morfológicas e bioquímicas em culturas primárias de astrócitos submetidos a estimulação elétrica por corrente contínua. Tem como intuito avaliar as possíveis alterações em células saudáveis que a eletroestimulação poderá causar em diferentes tempos de estimulação. Desta forma, será possível coletar dados importantes para futuros projetos com indução de doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas e tratamento por eletroestimulação, tanto em cultivo celular como em modelos animais. Servirá como projeto piloto a fim de otimizar futuros estudos do grupo e como triagem para estudos em animais. O grupo de pesquisa já trabalha com modelo de estimulação magnética em cultura celular e in vivo e pretende-se realizar um comparativo quanto aos diferentes tipos de estimulação. Para isso, será necessária a utilização de animais neonatos para o cultivo primário de células de astrócitos.
Metodologia
Cada experimento será divido nos seguintes grupos: I. Controle (células sem ETCC)
II. ETCC 5 minutos
III. ETCC 15 minutos
IV. ETCC 30 minutos
V. ETCC 40 minutos
Os animais serão retirados do biotério central da Universidade e imediatamente direcionados ao laboratório onde será realizada a cultura. Cada rato será exposto de forma individual a isoflurano (via inalatória) por no mínimo 10 minutos após cessar os movimentos, após será realizada a decapitação com tesoura cirúrgica. Todo o processo de eutanásia será realizado em local limpo, climatizado, livre de sons e cheiros externos,
e por experimentador devidamente treinado, a fim de garantir ao máximo possível o conforto do animal. Após decapitação, será realizada a retirada e dissociação mecânica do cortéx para a obtenção do pool de células. Em placas de 12 poços previamente impregnada com poli-L-lisina serão semeadas 3000.000 cél/poço (Funchal, 2014). As placas serão mantidas em incubadora a 37oC com 5% de CO2. Passando-se 24h será realizada a primeira troca de meio (DEMEN enriquecido com soro fetal bovino 10% + anfotericina B + gentamicina), a partir de então serão realizadas trocas de meio a cada 3 ou 4 dias. Após atingirem a confluência (aproximadamente 15 a 20 dias) será dado início ao protocolo de ETCC. Cada placa submetida a ETCC por um tempo pré- determinado, exceto o grupo controle. Ao final dos 7 dias, 24h após a última estimulação as placas serão preparadas para realização das seguintes análises:
- Viabilidade celular pelo método MTT;
- Identificação de células apoptóticas por meio de imunocitoquímica por DAPI; - Medição da atividade da catalase (CAT);
- Medição da atividade da superóxido dismutase (SOD);
- Medição da capacidade antioxidante total (ACAP);
- Medição do teor total de sulfidrila (SH);
- Medição de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS);
- Medição de apoptose celular por citometria de fluxo;
- Medição da fluidez da membrana;
- Análise do ciclo celular;
- Quantificação de BDNF;
II. ETCC 5 minutos
III. ETCC 15 minutos
IV. ETCC 30 minutos
V. ETCC 40 minutos
Os animais serão retirados do biotério central da Universidade e imediatamente direcionados ao laboratório onde será realizada a cultura. Cada rato será exposto de forma individual a isoflurano (via inalatória) por no mínimo 10 minutos após cessar os movimentos, após será realizada a decapitação com tesoura cirúrgica. Todo o processo de eutanásia será realizado em local limpo, climatizado, livre de sons e cheiros externos,
e por experimentador devidamente treinado, a fim de garantir ao máximo possível o conforto do animal. Após decapitação, será realizada a retirada e dissociação mecânica do cortéx para a obtenção do pool de células. Em placas de 12 poços previamente impregnada com poli-L-lisina serão semeadas 3000.000 cél/poço (Funchal, 2014). As placas serão mantidas em incubadora a 37oC com 5% de CO2. Passando-se 24h será realizada a primeira troca de meio (DEMEN enriquecido com soro fetal bovino 10% + anfotericina B + gentamicina), a partir de então serão realizadas trocas de meio a cada 3 ou 4 dias. Após atingirem a confluência (aproximadamente 15 a 20 dias) será dado início ao protocolo de ETCC. Cada placa submetida a ETCC por um tempo pré- determinado, exceto o grupo controle. Ao final dos 7 dias, 24h após a última estimulação as placas serão preparadas para realização das seguintes análises:
- Viabilidade celular pelo método MTT;
- Identificação de células apoptóticas por meio de imunocitoquímica por DAPI; - Medição da atividade da catalase (CAT);
- Medição da atividade da superóxido dismutase (SOD);
- Medição da capacidade antioxidante total (ACAP);
- Medição do teor total de sulfidrila (SH);
- Medição de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS);
- Medição de apoptose celular por citometria de fluxo;
- Medição da fluidez da membrana;
- Análise do ciclo celular;
- Quantificação de BDNF;
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se, que ao concluir este estudo, tenha-se melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta de astrócitos frente à eletroestimulação. Os resultados serão apresentados nos Salões de Iniciação Científica e eventos nacionais e internacionais. Além disso, prevemos a publicação em pelo menos 1 artigo internacional, um mestrado.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| ALECIA FERREIRA DA SILVA | |||
| AMANDA JULIAO DIAS DOS SANTOS | |||
| CAROLINE CRESPO DA COSTA | 1 | ||
| GABRIEL SILVA SANTOS | |||
| GIOVANA DUZZO GAMARO | 1 | ||
| IZABEL CRISTINA CUSTODIO DE SOUZA | 1 | ||
| JULIA GABRIELA KSZEZINSKI VIEGAS | |||
| JULIA LUCAS NEUMANN | |||
| LETÍCIA DEVANTIER KRÜGER | |||
| TCHANDRA MACHADO DE VARGAS |