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A busca por práticas agrícolas mais sustentáveis e eficientes tem impulsionado o desenvolvimento de estratégias inovadoras para melhorar a germinação e o desempenho das sementes de diversas culturas agrícolas (BULGARI et al., 2015; HAMEDANI et al., 2020).
Na germinação, as sementes estão expostas a uma série de estresses, como variações de temperatura, deficiências nutricionais e patógenos. Um dos principais mecanismos pelos quais esses estresses afetam as sementes é o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a capacidade antioxidante das células (MILLER; SHULAEV; MITTLER, 2008).
As células possuem um sistema antioxidante que ajuda a neutralizar as ERO e evitar danos em condições normais de ambiente. Esse sistema é composto por enzimas antioxidantes, como a catalase (CAT), a superóxido dismutase (SOD) e a peroxidase do ascorbato (APX), além de moléculas antioxidantes, como o ácido ascórbico e compostos fenólicos (TRIPATHY; OELMÜLLER, 2012). Tais componentes trabalham em conjunto para neutralizar as espécies reativas de oxigênio e proteger as células contra danos oxidativos (KUREK; PLITTA-MICHALAK; RATAJCZAK, 2019).
Para mitigar os efeitos do estresse oxidativo e promover uma germinação uniforme e rápida, tem sido explorado o uso de bioestimulantes a base de compostos naturais. Na cultura do tomate, por exemplo, o uso de bioestimulante a base de taninos favoreceu o crescimento das raízes e forneceu a nutrição adequada através da regulação da expressão de fatores de transcrição essenciais e genes associados ao estresse salino (CAMPOBENEDETTO et al., 2021). A aplicação desses bioestimulantes podem fortalecer o sistema antioxidante das sementes, aumentando a capacidade de neutralizar as espécies reativas de oxigênio e proteger as células contra danos oxidativos.
O tanino é um polifenol amplamente encontrado em várias espécies vegetais, como na Acácia Negra (Acacia mearnsii De Wild). Essa é uma espécie arbórea conhecida por produzir taninos em quantidades significativas que apresentam propriedades antioxidantes e são capazes de proteger as células vegetais contra os danos causados pelo estresse oxidativo. Contudo, ainda não há relatos se esse composto têm o potencial de estimular a germinação e promover o crescimento das plântulas em diferentes culturas, como na soja.
Nesse contexto, este estudo tem como objetivo investigar o uso de um bioestimulante à base de tanino de Acácia Negra na germinação de sementes de soja. Serão realizados experimentos em laboratório, nos quais diferentes concentrações do bioestimulante serão aplicadas às sementes. Serão avaliados parâmetros como taxa de germinação, vigor das plântulas e atividade antioxidante.

Para a realização do projeto, inicialmente, serão utilizadas sementes de soja de cultivares a serem estabelecidas conforme a disponibilidade e/ou interesse, com e sem tratamento de sementes com fungicida e inseticida adquiridas comercialmente. Outras culturas poderão ser selecionadas posteriormente.
As sementes serão imersas em soluções contendo bioestimulante a base de taninos, obtidas em parceria com empresas produtoras, em 10 concentrações (de 1,0 a 10,0 mL por kg de sementes, com intervalo de 1 mL/kg). Para cada tratamento serão utilizados quatro repetições de 50 sementes em papeis de germinação umedecidos com 2,5 vezes a massa do papel.
O teste de germinação será realizado a 25 °C durante oito dias (BRASIL., 2009). Em conjunto com o teste de germinação será realizado a primeira contagem de germinação aos 4 dias e contagens diárias para o cálculo do tempo médio de germinação (COOLBEAR; FRANCIS; GRIERSON, 1984) e do índice de velocidade de germinação (MAGUIRE, 1962). Ao final do teste será mensurado o comprimento das plântulas com uma régua milimetrada e avaliado a porcentagem de plântulas normais, anormais, sementes não germinadas e mortas/deterioradas.
Dez plântulas formadas serão separadas em raiz e parte aérea e mantidas em estufa a 60 °C para a obtenção da massa seca de ambas as partes. A partir dos resultados obtidos serão analisados a necessidade de realização das análises enzimáticas das sementes com e sem tratamento de sementes (fungicida/inseticida) e submetidas as seguintes análises:

Extração de enzimas antioxidantes e quantificação de proteínas
As amostras serão maceradas com nitrogênio líquido e 5% de polivinilpolipirrolidona (PVPP), homogeneizadas em 1,8 mL de tampão de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8 , contendo 0,1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 20 mM de ascorbato de sódio. Os extratos serão centrifugados a 12.000 g por 20 min a 4 o C. Os sobrenadantes serão coletados para a dosagem de atividade das enzimas antioxidantes e determinação do teor de proteínas. O conteúdo de proteínas será determinado pelo método de (OHKAWA; OHISHI; YAGI, 1979).

Atividade da enzima catalase (CAT)
Para a análise da atividade da enzima catalase (EC 1.11.1.6) será utilizado tampão de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0, e 12,5 mM peróxido de hidrogênio (NAKANO; ASADA, 1981). A atividade do CAT será mensurada como declínio na absorbância a 240 nm.
Atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A atividade da ascorbato peroxidase (EC 1.11.1.11) será determinada através do monitoramento da taxa de oxidação do ascorbato a 290nm (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977). O meio de reação será composto de tampão fosfato de potássio (pH 7,4), 0,1 mM peróxido de hidrogênio (H2O2), 0,5 mM ácido ascórbico e uma alíquota de enzima.
Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD)
A análise da atividade da enzima superóxido dismutase (EC 1.15.1.1) será realizada através do monitoramento da inibição da coloração com nitroblue-tetrazolium (NBT) a 560 nm numa reação contendo tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH 7,8, 14 mM metionina, 0,1 uM EDTA, 75 μM NBT e 2 μM de riboflavina (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977).
Extração e quantificação de peróxido de hidrogênio (H2O2) e peroxidação lipídica
Será utilizado 250 mg de matéria fresca, a qual será macerada em solução de ácido tricloroacético (TCA) a 0,1 %. O macerado será centrifugado a 12.000 x g por 20 min e o H2O2 será determinado de acordo com Velikova et al. (2000). Para isso, 0,5 mL do sobrenadante serão adicionados a 0,5 mL de tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) e 1 mL de iodeto de potássio 1 M. As leituras serão realizadas em espectrofotômetro a 390 nm e o teor de H2O2 calculado por meio da comparação das leituras com curva padrão obtida a partir de concentrações conhecidas de H2O2. Os resultados serão expressos em μmol de uM.g-1 MF.
A peroxidação lipídica será determinada através da medição da concentração de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conforme Cakmak e Horst (1991). Para isso, será utilizado 250 μL do sobrenadante obtido acima, adicionado a 1 mL da solução composta de 0,5% (p/v) de ácido tiobarbitúrico (TBA) e 10% (p/v) de TCA. O meio de reação será incubado a 95 °C por 30 minutos, na sequência a reação será paralisada pelo resfriamento rápido em banho de gelo. A absorbância das TBARS formadas será determinada em espectrofotômetro a 535 nm e 600 nm e a concentração do complexo MDA/TBA calculada pela seguinte equação: [MDA] = (A535 – A600)/(ξ.b) onde: ξ: (coeficiente de extinção = 1,56 x 10-5 cm-1) e b: (comprimento ótico = 1). Os resultados serão expressos em μmol de MDA/g-1 MF.

Conteúdo fenólico total
Aproximadamente 50 mg de tecidos vegetais serão moídos em nitrogênio líquido, extraído em 1,5 mL de HCl 0,1 N e submetido à sonicação em banho-maria por 30 min. Os extratos serão centrifugados a 12.000 g por 30 min a 4°C. O sobrenadante será recolhido e o pellet re-extraído. Os sobrenadantes serão reunidos e o volume completado para 5 mL com HCl 0,1 N. Para quantificação, 1 mL de 20% (p/v) Na2CO3 e 0,5 ml do reagente Folin-Ciocalteu serão adicionados e incubados a 100 °C por 1 min. O extrato será diluído para 50 mL com água e filtrado. A leitura será realizada em 750 nm. A curva padrão será estabelecida com 0,1% (p/v) pirogalol em HCl 0,1 N (Fett-Neto et al. 1992).

Após a realização do experimento envolvendo a germinação de sementes, outras fases do desenvolvimento das plantas poderão ser testadas através de experimentos em casas de vegetação ou a campo e, posteriormente, a realização das análises descritas acima.

Procedimentos estatísticos
Os experimentos serão conduzidos em delineamento inteiramente ao acaso com 4 repetições para as avaliações fisiológicas e 3 repetições para as análises enzimáticas.
Os resultados serão submetidos aos testes de normalidade e homogeneidade das variâncias, e quando necessário, serão transformados em arcsen. Em seguida, será realizado a análise de variância e análise de regressão em função das diferentes concentrações utilizadas. Análises multivariadas de agrupamento e de componentes principais serão realizadas e permitirão a avaliação em conjunto das avaliações enzimáticas e fisiológicas (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2020).

Metas e indicadores
• Padronização de uma concentração do bioestimulante ideal para o desenvolvimento de, pelo menos uma cultura de importância econômica;
• Fornecer subsídios para desenvolvimento de produtos sustentáveis;
• Divulgação dos resultados em eventos científicos;
• Publicação dos resultados em revista indexadas e com impacto científico.

Resultados
Será estabelecida a concentração ideal do bioestimulante para o tratamento de sementes de espécies cultivadas. Para alcançar esse objetivo, serão conduzidos testes de laboratório em ambiente controlado para avaliar o desempenho do bioestimulante.
Nesse experimento será monitorado a germinação e vigor das sementes tratadas com o bioestimulante, em comparação com grupo controle não tratado. O vigor das sementes será avaliado pelo índice de velocidade e tempo médio de germinação, comprimento e massa seca da parte aérea e sistema radicular. Além disso, será avaliado a atividade enzimática das plântulas, buscando entender melhor os mecanismos fisiológicos envolvidos nas respostas após os tratamentos.
Essa abordagem permitirá obter dados sobre a eficiência do bioestimulante, identificando a concentração ideal para melhorar a germinação e o vigor das sementes, bem como os possíveis impactos na atividade enzimática das plântulas.
Os resultados obtidos proporcionarão informações fundamentais para o desenvolvimento de uma solução personalizada, contribuindo para o avanço da agricultura.