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A colite ulcerativa, assim como a doença de Crohn, é uma doença inflamatória intestinal (DII) crônica e idiopática; entretanto, se diferencia da última por afetar exclusivamente o intestino grosso. A doença é caracterizada pela inflamação da mucosa do cólon, atingindo um segmento ou todo o seu comprimento. Apresenta sintomas como ulceração, sangramento e inflamação colônica, alterações na motilidade intestinal, diarreia, dor abdominal, entre outros, podendo variar de leve a severa (Gajendran et al., 2019; Krugliak Cleveland et al., 2022).
A patofisiologia da colite ulcerativa envolve fatores genéticos, ambientais, epiteliais, microbiológicos e imunológicos. Entre as terapias farmacológicas mais utilizadas no tratamento da doença encontram-se os aminossalicilatos, os glicocorticoides, os imunossupressores e as terapias biológicas direcionadas (Chang, 2020). Além de intervenções dietéticas (Keshteli et al., 2019; Fritsch et al., 2020), outras alternativas terapêuticas com compostos naturais vêm sendo estudadas (Liu et al., 2020; Wallimann et al., 2021), devido ao elevado índice de efeitos colaterais causados pelas terapias farmacológicas mencionadas anteriormente e seus elevados custos, havendo a necessidade de investigação de novas abordagens (Wang et al., 2020).
Entre os compostos que vêm adquirindo destaque como potencial agente terapêutico na colite ulcerativa, encontra-se a creatina (Wallimann et al., 2021), um composto formado pelos aminoácidos arginina, glicina e metionina, podendo ser sintetizada endogenamente, ou ingerida por meio da alimentação, principalmente pelo consumo de carnes e peixes. A suplementação oral com creatina monohidratada quimicamente pura é amplamente utilizada como recurso ergogênico na prática esportiva, sendo utilizada por atletas profissionais e amadores, devido a sua capacidade de aumentar os estoques musculares de creatina e fosfocreatina (de Souza e Silva et al., 2019; Wallimann et al., 2021), servindo como substrato energético para a ressíntese de trifosfato de adenosina (ATP) durante o exercício intenso de curta duração (Kraemer et al., 1999). Como o músculo liso intestinal e as células epiteliais intestinais também são dependentes do sistema creatina quinase/fosfocreatina como precursor energético, e a suplementação com creatina já demonstrou eficácia em melhorar o estado energético celular, aumentar a resiliência celular contra diversos agentes estressores, modular o sistema imunológico, apresentar ação antioxidante e anti-inflamatória, e atenuar a dor nociceptiva, esta apresenta elevado potencial terapêutico nas DII (Wallimann et al., 2021).
Portanto, devido ao número limitado de estudos que avaliem o potencial terapêutico da creatina nas DII, e a necessidade de novas abordagens de tratamento para a doença, o presente estudo visa avaliar os efeitos bioativos da suplementação de creatina monohidratada na colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos.

Avaliação do experimento in vivo
-Delineamento experimental
Será realizado cálculo amostral com nível de confiança de 95%, distribuídos em seis grupos com 8 animais cada (n=8). Um grupo como controle positivo, um controle negativo e quatro grupos tratamento. Serão utilizados 48 (n=48) modelos biológicos de ratos Wistar machos, provenientes do Biotério Central da UFPEL, após a aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA). Estes terão 60 dias de idade e serão mantidos em caixas plásticas, com quatro (n=4) animais em cada, em ambiente com controle de temperatura (23 ± 2 °C) e luz (12:12h ciclo escuro/claro), com acesso a ração (Nuvilab®) e água ad libitum. Os animais serão divididos randomicamente em seis grupos compostos por oito (n=8) animais cada, sendo um grupo controle, que receberá apenas ração padrão, um grupo controle + creatina 2%, que receberá a ração padrão com 2% de creatina monohidratada, um grupo controle + creatina 4%, que receberá a ração padrão com 4% de creatina monohidratada, um grupo colite, que receberá apenas ração padrão, um grupo colite + creatina 2%, que receberá a ração padrão com 2% de creatina monohidratada, e um grupo colite + creatina 4%, que receberá a ração padrão com 4% de creatina monohidratada, do 1º ao 19º dia de experimento. Os grupos colite, colite + creatina 2% e colite + creatina 4% receberão a indução da colite por administração intra-retal de ácido acético (4%) no 14º dia de experimento, com a eutanásia sendo realizada no 19º dia (Quadro 1). O experimento será conduzido no Laboratório de Nutrição Experimental, da Faculdade de Nutrição (UFPEL). Todos os procedimentos serão realizados de acordo com o “Guia para cuidados e uso de animais de laboratório” do National Research Council (NRC, 2011).
As rações suplementadas com creatina serão preparadas com a ração padrão (Nuvilab®) triturada e misturada com creatina monohidratada (Creapure®), na concentração de 2% ou 4% p/v. No 19º dia de experimento os animais serão submetidos a um jejum de 3h e, posteriormente, sedados com isoflurano e eutanasiados por punção cardíaca, seguindo os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea, 2004). O trato gastrointestinal será dessecado e armazenado parte em 10% de formalina tamponada, e parte armazenado para análises complementares. As amostras de sangue serão coletadas em tubos com anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) para análise do perfil bioquímico. Os demais órgãos coletados como fígado, coração, baço, cérebro e rim serão excisados individualmente para serem utilizados em análises complementares e/ou projetos futuros.

-Colite experimental induzida por Ácido Acético (AA)
Após 16h de jejum, a colite ulcerativa será induzida com ácido acético (4%), sob anestesia leve com isoflurano (inalação). Os animais dos grupos colíticos serão tratados com 2 ml de ácido acético (4%), preparado em solução salina (0,9%), com auxílio de um cateter de polipropileno (3 mm), o qual será inserido no cólon via intra-retal 7 cm de profundidade. Os grupos controle serão tratados com 2 ml de solução salina utilizando o mesmo método, para servir como o controle do grupo exposto. Imediatamente após a aplicação das soluções via intra-retal, os animais serão mantidos em posição Trendelenburg supinada por 30 segundos para evitar vazamento, seguido da lavagem colônica com solução salina (Mousavizadeh et al., 2009; Bhargavi et al., 2019). Ao longo do protocolo será avaliado o índice de atividade da doença (IAD), onde os animais serão monitorados em relação a mudanças de peso corporal, presença de sangue nas fezes e consistência das mesmas. O consumo alimentar (CA) dos animais também será monitorado, com pesagem (g) a cada 6 dias (1º, 6º, 12º, 18º dia do experimento). No 19º dia, os animais serão eutanasiados e os cólons serão coletados e lavados com solução salina (0,9%).

-Avaliação da atividade da doença
O consumo alimentar (CA) e a gravidade da colite serão avaliados ao longo do experimento pelo IAD (Larner et al., 2019). Os resultados serão expressos pela média do grupo por parâmetro, sendo considerado significativo aqueles grupos que atingiram escores superiores a 0,5 (Ran et al., 2008).

-Avaliação macroscópica do cólon
O cólon será aberto longitudinalmente sobre a margem mesentérica e lavado em solução salina (0,9%) para análise. As alterações macroscópicas na mucosa colônica serão avaliadas com a utilização de uma escala de dano macroscópico (Topal et al., 2014).

-Avaliação microscópica do cólon
A avaliação microscópica do cólon será realizada de acordo com Gil-Martinez et al. (2019). Os parâmetros serão somados, sendo que o máximo escore histológico para colite grave é igual a 11 (Laroui et al., 2012).

-Avaliação do estresse oxidativo
Após a eutanásia dos animais serão retiradas amostras do cólon que serão armazenados a -80ºC até a realização das análises. Todas as determinações bioquímicas serão realizadas nos fragmentos homogeneizados do cólon. Para o cálculo das análises de CAT, SOD e GPx, a proteína tecidual será quantificada utilizando o método de Lowry (Lowry et al., 1951).

-Determinação da atividade da enzima Catalase (CAT)
A atividade de CAT será realizada de acordo com Aebi (1984). Uma unidade de atividade de CAT será definida como a quantidade de enzima que decompôs 1 mM de H2O2 por min a 37 °C. A atividade específica será expressa em unidades/mg de proteína.

-Determinação da atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD)
A atividade da SOD será realizada de acordo com o descrito por Boveris (1984). Uma unidade de atividade da SOD será definida como a quantidade de enzima necessária para diminuir a formação de superóxido em 50%. A atividade específica será expressa em unidades/mg de proteína.

-Determinação da atividade da enzima Glutationa Peroxidase (GPX)
A atividade da GPx será mensurada de acordo com o descrito por Wendel (1981). Uma unidade GPx é definida como 1 µmol de NADPH consumido por minuto, e a atividade específica é representada como unidades/mg de proteína.

-Determinação de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
A Reação ao Ácido Tiobarbitúrico será determinada de acordo com a metodologia de Ohkawa et al. (1979) Os produtos da reação serão determinados por medida de absorbância em 532nm, em espectrofotômetro. A concentração de TBARS será calculada por meio de uma curva padrão, concentrações conhecidas de 1,1,3,3 – tetrametoxipropano, e os resultados serão expressos em nm de Malonaldeído (MDA)/g de amostra.

-Determinação da expressão gênica de enzimas relacionadas a resposta inflamatória
Para determinação da expressão gênica, as amostras de cólon serão coletadas imediatamente após a decapitação e armazenadas a -80ºC. As amostras serão homogeneizadas com 1 mL Qiazol (Qiagen, Valencia, EUA). O RNA total será isolado e purificado seguindo o protocolo do Qiazol. As reações de transcrição reversa serão realizadas utilizando 1 µg de RNA por meio de kit transcrição reversa com inibidor de RNase (Applied Biosystems, Foster City, EUA) em um volume de 10 µL. Será realizada a Reação de Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR-RT) para avaliar a expressão dos genes alvo. As reações de PCR serão realizadas em triplicata em um volume de 12 µL utilizando SYBR Green Master mix (Roche) e a fluorescência será quantificada Eco Real Time (Ilumina). Para cada ensaio serão realizados 40 ciclos de PCR e uma curva de dissociação será incluída no final da reação a fim de verificar a amplificação de um único produto de PCR. Os dados serão reportados como folds over the minimum. Cada placa de ensaio incluirá um controle negativo.

-Avaliação bioquímica: serão analisados os parâmetros de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gamma glutamil transferase (GGT), albumina, creatinina, proteína C reativa (PCR), testosterona total, lipopolissacarídeos (LPS) em amostra sanguínea.

-Análise hematológica
Os paramentros hematológicos dos ratos serão avaliados após pulsão cardíaca e coleta do sangue total em tubos contendo EDTA (Vacutainer®). As determinações serão realizadas de forma automatizada utilizando o equipamento KX21 (Sysmex). Os leucocitos totais (WBC), eritrócitos totais (RBC), hemoglobina (Hbg), Hematocrito (HCT) e plaquetas serão determinados e utilizados no presente estudo.

-Análise dos dados
Para análise estatística, será utilizada a análise de variância (two-way ANOVA), com auxílio do Software GraphPad Prism 8.0.1. Considerando-se diferença significativa para ANOVA, será utilizado o Teste Tukey.

-Aspectos éticos
Serão usadas todas as estratégias que visam minimizar o número de animais utilizados no experimento. O tamanho do grupo será planejado segundo o relato da literatura e cálculo amostral para cada um dos modelos e/ou ensaios.
Os ensaios experimentais serão escolhidos visando induzir o mínimo de desconforto possível. Em muitos casos a metodologia descrita na literatura será adaptada, abdicando-se de medidas que tragam mais danos aos animais e ou introduzindo alternativas que levem ao menor desconforto. Todos os procedimentos operacionais realizados serão embasados no Guide for the Care and Use for Laboratory Animals – ILAR/EUA e no Manual para Técnicos em Bioterismo (COBEA, 2004).
Os animais serão eutanasiados isoladamente dos demais para que não haja estresse. As carcaças dos animais eutanasiados serão dispensadas em saco plástico fechado e depositados em bombona com tampa para recolhimento por empresa especializada. Materiais tóxicos e contaminados serão tratados conforme protocolo da instituição.

Pretende-se com este estudo obter uma redução no índice de atividade da doença e da inflamação intestinal e sistêmica, assim como melhora dos níveis hormonais nos animais tratados com creatina monohidratada, quando comparados ao controle. Da mesma forma, pretende-se obter uma edução da permeabilidade intestinal e do estresse oxidativo, e melhora dos níveis bioquímicos e enzimáticos nos animais tratados com creatina monohidratada, quando comparados ao controle.