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A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença complexa, incapacitante, com alto risco de morte e que acomete grande número de pessoas. Ela se caracteriza pelo remodelamento do parênquima pulmonar que leva ao aumento da resistência vascular pulmonar e, consequentemente, a hipertrofia do ventrículo direito (VD), tentando contrabalançar a maior pós-carga imposta (Xu et al, 2022). Apesar de benéfica a curto prazo, a hipertrofia compensatória do VD está associada com a piora funcional com o passar do tempo, culminando com uma insuficiência cardíaca direita (Shah et al, 2022). Apesar da patogênese e da fisiopatologia da HAP ainda não serem completamente entendidas, avanços na classificação e nos mecanismos envolvidos vêm sendo apresentados. Dentre outros fatores genéticos e ambientais associados com a doença, é conhecido que as mulheres apresentam maior risco para o acometimento da HAP (Frump et al, 2021). Entretanto, elas têm um melhor prognóstico, com melhor perfil hemodinâmico e melhor função do VD (Chung et al, 2010). Neste contexto, emerge a curiosidade de estudarmos se o melhor prognóstico está relacionado com os hormônios sexuais femininos. De fato, tem sido mostrado que o estrogênio é capaz de retardar a progressão da HAP em estudos experimentais em modelo animal, assim como é capaz de estimular a neoangiogênese cardiopulmonar e suprimir a inflamação, fibrose e hipertrofia do VD (Cheron et al, 2021). O estrogênio, um hormônio esteroide encontrado em níveis mais elevados nas mulheres em fase reprodutiva, atua como um antioxidante per se e por estimular os antioxidantes endógenos (Marlatt et al, 2022). Portanto, este é capaz de estabilizar espécies reativas de oxigênio e, assim, mitigar/prevenir o estresse oxidativo. De fato, tem sido mostrado que o estrogênio atua prevenindo o estresse oxidativo e nitrosativo e, consequentemente, é capaz de melhorar a biodisponibilidade do óxido nítrico, um potente vasodilatador dependente do endotélio (Schenkel et al, 2013). Por outro lado, seus níveis séricos diminuem significativamente após a menopausa, acarretando em menor proteção antioxidante e piora na regulação do tônus vascular. Somado a isso, sintomas como ondas de calor, suor noturno, alterações do sono, oscilações de humor, além do aumento de risco cardiometabólico, são comumente relatados (Takahashi et al, 2017; Santoro et al, 2015). A forma mais eficaz para amenizar tais problemas é através da terapia de reposição hormonal com estrogênio. Contudo, nem todas as mulheres podem fazer uso de tal medicação, pois os riscos da reposição hormonal (câncer de mama, morte súbita e eventos tromboembólicos, etc.) se sobrepõem aos benefícios (Cheron et al, 2021). Desta forma, a reposição hormonal deve ser vista de forma individual, levando-se em conta os possíveis benefícios e malefícios. Uma vez que os níveis de estrogênio estão inversamente relacionados com o prognóstico da HAP e que algumas mulheres não podem fazer o uso da reposição de estrogênio após a menopausa, destacamos a necessidade da busca por alternativa antioxidante visando a regulação do estado redox e da função cardiovascular. Neste contexto, destacamos a melatonina. A melatonina é um hormônio secretado pela glândula pineal, importante regulador do ciclo circadiano, com diferentes ações fisiológicas (Cipolla-Neto et al, 2022). Estudos relataram propriedades diversas deste, como ação antioxidante, foco deste trabalho. A melatonina é capaz de agir como um cardioprotetor por estabilizar espécies reativas de oxigênio (EROs) e radicais livres, limitando o dano oxidativo, agindo também, como um potente antiinflamatório (Chitimus et al, 2020). Sendo assim, testar sua influência em modelo de HAP induzido com monocrotalina em camundongos fêmeas com diferentes níveis de estrogênio se impõem.

Experimento 1 - Tratamento com melatonina de camundongos com hipertensão arterial pulmonar em estropausa ou ciclando

Serão utilizados, neste experimento, 88 camundongos C57BL/6 fêmeas com 8 semanas de vida. Após aclimatação às condições do biotério, serão induzidas a estropausa química utilizando 4-vinilciclohexeno diepóxido (VCD) por 20 dias consecutivos (160mg/kg i.p.) conforme descrito previamente por Ávila et al. 2023. Sessenta dias após o termino da indução, os animais terão o ciclo estral monitorado durante 7 dias consecutivos por esfregaço vaginal para confirmação da pausa do ciclo estral em diestro. Então, a HAP será induzida pela administração de monocrotalina (600mg/kg, s.c) uma vez por semana, durante 8 semanas consecutivas (Nishii et al, 2006) e a suplementação com melatonina (10mg/Kg i.p.) será administrada diariamente nas 3 primeiras semanas de indução da HAP.

Grupos:
1. Controle (CTRL): animais que receberão placebo para indução da estropausa;
2. Estropausa (EP): animais que receberão VCD para indução da estropausa;
3. Hipertensão arterial pulmonar (HAP): animais que receberão placebo para indução da estropausa e que receberão monocrotalina para indução da HAP
4. EP + melatonina (MEL): animais que receberão VCD para indução da estropausa + tratamento com melatonina;
5. EP+HAP: animais que receberão VCD para indução da estropausa + indução da HAP;
6. HAP + MEL: animais que receberão monocrotalina para indução da HAP + tratamento com melatonina
7. EP+MEL: animais que receberão MCT para indução da HAP + tratamento com melatonina
8. EP + HAP + MEL: animais que receberão VCD para indução da estropausa + indução da HAP + tratamento com melatonina

Estropausa: após aclimatação, os animais receberão 160mg/Kg de 4-vinilciclohexeno diepóxido (VCD) via intraperitoneal ou óleo de gergelim diariamente, 20 dias consecutivos, conforme descrito previamente por Ávila et al. 2023. Será monitorada a fase do ciclo estral via citologia vaginal para confirmação da pausa do ciclo em diestro. Para isso, será introduzido 10µL de solução salina (NaCl 0,9%) na abertura vaginal e imediatamente coletada e colocada em uma lâmina de vidro para análise microscópica conforme descrito previamente por Schenkel et al, 2013.

Hipertensão arterial pulmonar (HAP): Camundongos fêmeas C57BL/6 irão receber injeção subcutânea de 600mg/kg de monocrotalina ou solução salina (NaCl 0,9%), uma vez por semana, por 8 semanas, conforme descrito por Nishii et al (2006). A diluição da monocrotalina, sendo 600 mg para 1 mL de volume final, será realizada em 0,5 mL de HCl 1N. Após solubilizar, o pH será ajustado até atingir 7,4 com adição de NaOH 1 N e, para complementar o volume final será acrescentado NaCl 0,9% (Farahmand et al, 2004).

Melatonina: Os animais receberão injeção intraperitoneal de 10mg/Kg de melatonina ou veículo, diariamente, por 3 semanas. A melatonina será diluída em etanol e água destilada (concentração final de etanol 0,5%) (Ma et al, 2021).

Eutanásia: Ao final do experimento, os animais serão anestesiados com isoflurano e eutanasiados por deslocamento cervical. Os tecidos serão devidamente coletados e acondicionados para análises histológicas e bioquímicas. As artérias aortas dos animais dos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 serão coletadas e imersas em uma placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit (37°C, pH 7,4) para retirada cuidadosa do tecido conjuntivo e adiposo Feito isso, elas serão separadas em dois anéis de aproximadamente 3 mm de comprimento e serão fixados com fios de aço inoxidável à alavanca de um transdutor de deslocamento de força (TIM-100, AVS) para realização dos protocolos descritos abaixo utilizando o Sistema de Aquisição de Dados PowerLab (PL3508/P, ADInstruments (Mulvany e Halpern 1977).

Reatividade vascular

Protocolo 1 (integridade do vaso): as artérias serão estabilizadas por aproximadamente 20 minutos em tensão fixa de 1,0g. Em seguida, será adicionado cloreto de potássio (KCl, 120 mM) a solução de Krebs-Henseleit para avaliarmos a integridade funcional do vaso e para obtermos a tensão máxima. Feito isso, a solução será trocada três vezes para retirada do KCl e os vasos serão novamente estabilizados para realização dos demais testes.

Ao término do protocolo um, o meio de incubação será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados, conforme descrito previamente.

Protocolo 2 (resposta vasodilatadora): Os vasos serão pré contraídos com fenilefrina (10-6 M) em ato contínuo submetidos a uma curva de acetilcolina (Ach 10-10 até 10-5 M) para análise da resposta vasodilatadora dependente do endotélio (Peçanha et al, 2008).
Ao término do protocolo dois, o meio de incubação será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados, conforme descrito previamente.

Protocolo 3 (I/R): Nas aortas dos grupos I/R, será trocado o meio para solução de Krebs modificada (sem glicose e sem aerar com mistura de carbogênio O2 95% e CO2 5%). Após 1 hora ou 3 horas, será trocado o meio para solução de Krebs padrão e o carbogênio será ligado para reperfusão do vaso. Em ato contínuo, o protocolo 2 será repetido.
Ao término do protocolo três, o meio de incubação será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados, conforme descrito previamente.

Protocolo 4 (I/R 30min): o protocolo 2 será novamente repetido passados 30 minutos do fim do protocolo 3 visando uma análise tardia do vaso após privação de glicose e oxigênio.
Ao término do protocolo quatro, o meio de incubação será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados, conforme descrito previamente.

Protocolo 5 (NPS): A resposta vasodilatadora independente do endotélio será avaliada de forma semelhante à descrita no protocolo 2, porém com a utilização de nitroprussiato de sódio (NPS 10-10 até 10-5 M) no lugar da Ach (Peçanha et al, 2008).

Experimento 2 – Efeito vasomodulador da melatonina em anéis de aorta
Para realização do segundo experimento, dois anéis de aorta por animal serão coletados de 30 camundongos C57Bl/6 fêmeas (10 anéis de aorta por grupo) e preparados conforme descrito no experimento 1. Após o preparo, esses serão submetidos aos protocolos 1 e 2 descritos acima. Em seguida, daremos início ao protocolo 6.

Protocolo 6 (melatonina): Os anéis de aorta serão incubados com melatonina (1mmol) e ou L-NAME e ou L- ARG durante o período de isquemia, e posteriormente, serão realizados os protocolos 3 e/ou 5.
• Grupo CTRL
• Grupo melatonina
• Grupo L-NAME
• Grupo L-ARG
• Grupo melatonina + L-NAME
• Grupo melatonina + L-ARG

Análises histológicas
O coração e os pulmões dos animais serão fixados em formalina tamponada a 10%, processadas em concentrações crescentes de álcool e xilol e parafinizados em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Feito isso, as amostras serão cortadas em seções de 3 μm (pulmão) e 4 μm (VD e VE) de espessura, fixadas em lâminas e coradas com tricômito de masson, hematoxilina e eosina (HE) ou com picrosirius red para análise em microscópio por pesquisador experiente (Bruce et al, 2015; Li et al, 2013). Serão mensurados os seguintes parâmetros: área dos cardiomiócitos, deposição de colágeno, infiltrado inflamatório e espessamento da parede dos vasos sanguíneos.

Análise Morfométrica
O coração de uma parte dos animais será dissecado imediatamente após remoção para separar a parede livre do ventrículo direito do septo e do ventrículo esquerdo. A análise de hipertrofia cardíaca será feita conforme descrito por Türck et al. (2018) onde o peso do ventrículo direito e o comprimento da tíbia da pata traseira direita são usados como referência.

Análise bioquímica
Preparação dos tecidos
Amostras de pulmão e do ventrículo direito serão homogeneizados com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogeneizer, OMNI International, EUA) na presença de 1,15% de KCl (5 ml/g de tecido) e 100 mM de fenilmetil sulfonil fluoreto. Feito isso, as amostras serão centrifugadas (20 minutos a 10000 x g a 4°C) e o sobrenadante será coletado e armazenado a -80 °C até o início das análises (Zimmer, 2020).

As amostras serão quantificadas conforme protocolos previamente descritos:
- Quantificação de proteínas (Lowry et al, 1951).
- Lipoperoxidação (Ohkawa et al, 1979);
- Espécies reativas de oxigênio totais (LEBEL et al. 1992);
- Enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Marklund, 1974), catalase (Aebi, 1984) e glutationa peroxidase (Flohé; Günzler, 1984)
- Tiorredoxina redutase (Holmgren; Bjornstedt, 1995)
- Óxido Nítrico Sintase (Reis et al, 2019);

Avaliação do imunoconteúdo por Western Blot
Amostras de pulmão e coração serão homogeneizadas e preparadas para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se o anticorpo primário ERα, ERβ, eNOS, SOD, CAT, TRx-1, VUDP-1 e GAPDH. Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil).

Através deste projeto espera-se que a melatonina atue como antioxidante, atenuando a progressão da HAP, visando sua utilização como coadjuvante no tratamento da doença, principalmente naquelas mulheres que não podem usufruir da terapia de reposição hormonal com estrogênio.