Nome do Projeto
Potencial cardioprotetor do Pleurotus albidus e análise do receptor da IL-33 como biomarcador inflamatório na progressão da hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina em camundongos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/03/2024 - 17/10/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Apesar das crescentes descobertas medicamentosas e do aprofundamento científico sobre a hipertensão arterial pulmonar, esta doença continua com diagnóstico tardio e sem cura. Os fármacos mais utilizados no seu tratamento convencional, além de diversos efeitos colaterais, não são eficazes em grande parte dos pacientes. Assim, tem se buscado entender melhor os mecanismos envolvidos na doença para identificar marcadores de sua progressão e também alternativas adjuvantes ao tratamento convencional e que possam minimizar os efeitos da doença. Neste contexto, os níveis séricos da interleucina-33 (IL-33) e a sinalização intracelular por ela ativada são alvos de interesse, em potencial a resposta inflamatória dos membros da interleucina-1. O papel do sistema IL-33/ST2 tem sido estudado como um biomarcador para o diagnóstico diferencial e prognóstico de diversas doenças, podendo ser usado na hipertensão arterial pulmonar. O presente projeto visa determinar se os níveis séricos de IL-33 podem ser utilizados como um biomarcador para o prognóstico da hipertensão arterial pulmonar induzida pela monocrotalina (600 mg/Kg) em camundongos C57Bl/6 fêmeas e machos, com aproximadamente 60 dias. Portanto iniciaremos com um experimento com tempos distintos de indução por monocrotalina no modelo biológico escolhido, seguido da determinação dos níveis do receptor do sST2/IL33R na progressão da hipertensão arterial pulmonar durante 2, 4, 6 e 8 semanas e avaliação da influência do extrato de P. albidus (500 mg/ Kg) administrado por via intragástrica, por tempo a ser confirmado após experimento inicial, sobre a sinalização IL-33/ST2 no modelo de hipertensão arterial pulmonar. Os animais submetidos ao lavado broncoalveolar, serão anestesiados previamente com quetamina (80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg), sendo eutanasiados por deslocamento cervical. Aqueles submetidos a punção cardíaca passarão por anestesia prévia com isoflurano (dose ao efeito) e eutanasiados também por deslocamento cervical. Portanto, serão feitas análises do lavado broncoalveolar, histológicas, das enzimas antioxidantes e das espécies reativas de oxigênio.
Objetivo Geral
Avaliar o potencial cardioprotetor do P. albidus e determinar se os níveis do receptor solúvel da IL-33 podem ser correlacionados como um biomarcador inflamatório na progressão da hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina em camundongos C57BL/6.
Justificativa
Apesar das crescentes descobertas medicamentosas e do aprofundamento científico sobre o tema, a HAP é uma doença de diagnóstico tardio e sem cura. Chama a atenção que os fármacos mais utilizados no seu tratamento convencional, além de diversos efeitos colaterais, não são eficazes em grande parte dos pacientes. Assim, tem se buscado entender melhor os mecanismos envolvidos na doença para identificar marcadores de sua progressão e também alternativas adjuvantes ao tratamento convencional e que possam minimizar os efeitos da doença.
Neste contexto, os níveis séricos da interleucina-33 (IL-33) e a sinalização intracelular por ela ativada são alvos de interesse em potencial.
A descoberta recente da IL-33 como um ligante do receptor ST2, conhecidamente relacionado com a resposta inflamatória dos membros da interleucina-1, reforçou tal influência. Desde então, o papel do sistema IL-33/ST2 como um marcador para o diagnóstico diferencial e prognóstico de diversas doenças têm sido estudado (MOLOFSKY et al., 2015; SCHMITZ et al., 2005). Apesar dos mecanismos ainda não serem completamente compreendidos, já foi mostrado que ao se ligar no receptor ST2 a IL-33 desencadeia uma cascata de sinalização intracelular que inicia pela ativação da Myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) e finaliza pela translocação do fator de transcrição nuclear kB (NFkB) para o núcleo celular (GRIESENAUER; PACZESNY, 2017; KAKKAR; LEE, 2008). Portanto, uma vez que a IL-33 se apresenta como uma alarmina, molécula associada com momentos críticos de inflamação, e que os níveis séricos de ST2 solúvel se correlacionam com a piora da função pulmonar e com o risco cardiovascular, a interação IL-33/ST2 emerge como alvo terapêutico em potencial na hipertensão arterial pulmonar (HAP).
Neste sentido, Indralingam et al., 2022, utilizando animais knockout para o ST2 (ST2-/-) e para MyD88 (MyD88-/-) num modelo de hipertensão pulmonar com administração de Sugen e hipóxia com 10% de oxigênio por 3 semanas, observaram que o desenvolvimento da doença é dependente dessa via de sinalização. Esse foi o primeiro trabalho que mostrou a influência da via de sinalização da IL-33 com o desenvolvimento da hipertensão pulmonar.
Tais achados recentes motivaram nosso grupo de pesquisa em determinar se os níveis dessa alarmina, bem como sua sinalização, também são relevantes na HAP induzida pela monocrotalina, modelo clássico que mimetiza a HAP observada em humanos com extrema facilidade e já é bem consolidado (LALICH; MERKOW, 1961; WILSON et al., 1992; YAN; HUXTABLE, 1995).
Com foco nas alterações do estado redox ao longo do desenvolvimento da HAP, nosso grupo de pesquisa mostrou uma diminuição na capacidade antioxidante após administração da monocrotalina, que resultou em maior dano oxidativo em diversos tecidos (ZIMMER et al., 2021). Somado a isso, o estresse oxidativo foi associado com a piora funcional do ventrículo direito e, consequentemente, com a maior mortalidade (TÜRCK, et al., 2022). Tal oscilação temporal observada nos parâmetros de estresse oxidativo e função cardiovascular nos sugerem a existência de janelas terapêuticas que podem ser exploradas de forma diferencial para se testar terapias alternativas ao tratamento da HAP.
Neste contexto, compostos naturais têm sido cada vez mais testados visando mitigar/tratar diversas doenças. Dentre outros, os cogumelos merecem destaque por apresentarem um bom valor nutricional, além de propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias (ELLAN et al, 2019). De fato, nosso grupo mostrou que o extrato do cogumelo Pleurotus albidus (P. albidus) foi eficaz em atenuar o estresse oxidativo in vitro em homogeneizados de corações e artérias aortas, efeito associado com a presença de compostos fenólicos e ergotioneína no mesmo (REIS et al., 2022). Ademais, Gambato et. al. 2018 também observaram que o extrato hidroalcoólico do P. albidus apresentou ação protetora aos danos oxidativos mitocondriais em modelo de hiperglicemia. Em estudos mais recentes do nosso grupo, mas ainda não publicados, temos observado que este extrato apresenta, além das bem descritas ações antioxidantes e anti-inflamatórias, potencial antiviral e antitumoral.
Portanto, com a realização do presente projeto objetivamos determinar se o sistema IL-33/ST2 pode ser utilizado como um biomarcador de dano ao tecido pulmonar e cardíaco em modelo de HAP induzida por monocrotalina. Ademais, buscamos identificar se o extrato de P. albidus apresenta potencial terapêutico adjuvante no tratamento da HAP por suas características antioxidantes e anti-inflamatórias. Tais resultados nos possibilitarão avançar no conhecimento dos mecanismos da HAP e abrirão novas alternativas terapêuticas.
Neste contexto, os níveis séricos da interleucina-33 (IL-33) e a sinalização intracelular por ela ativada são alvos de interesse em potencial.
A descoberta recente da IL-33 como um ligante do receptor ST2, conhecidamente relacionado com a resposta inflamatória dos membros da interleucina-1, reforçou tal influência. Desde então, o papel do sistema IL-33/ST2 como um marcador para o diagnóstico diferencial e prognóstico de diversas doenças têm sido estudado (MOLOFSKY et al., 2015; SCHMITZ et al., 2005). Apesar dos mecanismos ainda não serem completamente compreendidos, já foi mostrado que ao se ligar no receptor ST2 a IL-33 desencadeia uma cascata de sinalização intracelular que inicia pela ativação da Myeloid differentiation primary response 88 (MyD88) e finaliza pela translocação do fator de transcrição nuclear kB (NFkB) para o núcleo celular (GRIESENAUER; PACZESNY, 2017; KAKKAR; LEE, 2008). Portanto, uma vez que a IL-33 se apresenta como uma alarmina, molécula associada com momentos críticos de inflamação, e que os níveis séricos de ST2 solúvel se correlacionam com a piora da função pulmonar e com o risco cardiovascular, a interação IL-33/ST2 emerge como alvo terapêutico em potencial na hipertensão arterial pulmonar (HAP).
Neste sentido, Indralingam et al., 2022, utilizando animais knockout para o ST2 (ST2-/-) e para MyD88 (MyD88-/-) num modelo de hipertensão pulmonar com administração de Sugen e hipóxia com 10% de oxigênio por 3 semanas, observaram que o desenvolvimento da doença é dependente dessa via de sinalização. Esse foi o primeiro trabalho que mostrou a influência da via de sinalização da IL-33 com o desenvolvimento da hipertensão pulmonar.
Tais achados recentes motivaram nosso grupo de pesquisa em determinar se os níveis dessa alarmina, bem como sua sinalização, também são relevantes na HAP induzida pela monocrotalina, modelo clássico que mimetiza a HAP observada em humanos com extrema facilidade e já é bem consolidado (LALICH; MERKOW, 1961; WILSON et al., 1992; YAN; HUXTABLE, 1995).
Com foco nas alterações do estado redox ao longo do desenvolvimento da HAP, nosso grupo de pesquisa mostrou uma diminuição na capacidade antioxidante após administração da monocrotalina, que resultou em maior dano oxidativo em diversos tecidos (ZIMMER et al., 2021). Somado a isso, o estresse oxidativo foi associado com a piora funcional do ventrículo direito e, consequentemente, com a maior mortalidade (TÜRCK, et al., 2022). Tal oscilação temporal observada nos parâmetros de estresse oxidativo e função cardiovascular nos sugerem a existência de janelas terapêuticas que podem ser exploradas de forma diferencial para se testar terapias alternativas ao tratamento da HAP.
Neste contexto, compostos naturais têm sido cada vez mais testados visando mitigar/tratar diversas doenças. Dentre outros, os cogumelos merecem destaque por apresentarem um bom valor nutricional, além de propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias (ELLAN et al, 2019). De fato, nosso grupo mostrou que o extrato do cogumelo Pleurotus albidus (P. albidus) foi eficaz em atenuar o estresse oxidativo in vitro em homogeneizados de corações e artérias aortas, efeito associado com a presença de compostos fenólicos e ergotioneína no mesmo (REIS et al., 2022). Ademais, Gambato et. al. 2018 também observaram que o extrato hidroalcoólico do P. albidus apresentou ação protetora aos danos oxidativos mitocondriais em modelo de hiperglicemia. Em estudos mais recentes do nosso grupo, mas ainda não publicados, temos observado que este extrato apresenta, além das bem descritas ações antioxidantes e anti-inflamatórias, potencial antiviral e antitumoral.
Portanto, com a realização do presente projeto objetivamos determinar se o sistema IL-33/ST2 pode ser utilizado como um biomarcador de dano ao tecido pulmonar e cardíaco em modelo de HAP induzida por monocrotalina. Ademais, buscamos identificar se o extrato de P. albidus apresenta potencial terapêutico adjuvante no tratamento da HAP por suas características antioxidantes e anti-inflamatórias. Tais resultados nos possibilitarão avançar no conhecimento dos mecanismos da HAP e abrirão novas alternativas terapêuticas.
Metodologia
Experimento 1
Uma vez que a literatura apresenta variações na forma como induzir a HAP utilizando monocrotalina em camundongos, propomos a utilização de tempos distintos para a confirmação da eficácia do modelo em animais C57BL/6 de ambos os sexos. Diante disso utilizaremos a dose de 600 mg/Kg administrada por via intraperitoneal (RIBEIRO et al. 2017, SETA et al., 2011) durante 2, 4, 6 e 8 semanas consecutivas, com ou sem acompanhamento contínuo após indução. Serão utilizados 132 camundongos C57BL/6 (66 machos e 66 fêmeas) divididos em 11 grupos experimentais. Ao término do período experimental, eles serão subdivididos para análise do lavado broncoalveolar (n=6) e para coleta de sangue por punção cardíaca (n=6) para analisar os níveis do receptor do sST2/ IL33. Todos os animais serão advindos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas. Feito isso, será realizada a coleta e preparo dos tecidos do coração e pulmões para análises histológicas e bioquímicas.
Animais e grupos experimentais
1. Controle 2w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 3 ° semana experimental.
2. Monocrotalina- 2w - (MCT-2w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 3° semana experimental.
3. Monocrotalina- 2w - acompanhamento contínuo (MCT-2w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 9 ° semana experimental.
4. Controle 4w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 5° semana experimental.
5. Monocrotalina- 4w - (MCT-4w): animais que receberão MCT animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 5° semana experimental.
6. Monocrotalina- 4w - acompanhamento contínuo (MCT-4w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
7. Controle 6w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 7° semana experimental.
8. Monocrotalina- 6w (MCT-6w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 7° semana experimental.
9. Monocrotalina- 6w - acompanhamento contínuo (MCT-6w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
10. Controle 8w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 8 semanas consecutivas (totalizando 8 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
11. Monocrotalina- 8w (MCT-8w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 8 semanas consecutivas (totalizando 8 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
Experimento 2
Serão utilizados 48 camundongos C57BL/6 machos e fêmeas (60 dias) advindos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas, divididos em 4 grupos, que serão submetidos a indução à hipertensão arterial pulmonar por uso de monocrotalina na dose de 600 mg/ Kg, com tempo e via a ser confirmado após resultados do teste piloto.
1.Controle (CTRL): animais que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal e por gavagem intragástrica;
2.Pleurotus albidus (P.albidus): animais que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal e que serão tratados com extrato de P. albidus por gavagem intragástrica;
3.Monocrotalina (MCT): animais que receberão monocrotalina (600mg/Kg) (1 dose por semana), em tempo e via ainda a ser estabelecido após teste piloto, e que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por gavagem intragástrica;
4.Monocrotalina + P. albidus (MCT-P.albidus): animais que receberão monocrotalina (600mg/Kg) (1 dose por semana), em tempo e via ainda a ser estabelecido após teste piloto, e que serão tratados com extrato de P. albidus por gavagem intragástrica;
O tratamento com extrato hidroalcoólico do cogumelo Pleurotus albidus terá início 24 horas após a primeira administração de monocrotalina e será realizado diariamente ao longo de todo período experimental. Para isso, o extrato de Pleurotus albidus liofilizado será diluído em água destilada e administrado 1 vez por dia (entre 16-17h) por gavagem intragástrica (500mg/kg) conforme descrito previamente por Da costa et al. (2021). Os animais dos grupos 1 e 3 passarão pelo mesmo procedimento de gavagem intragástrica, porém receberão apenas água destilada no mesmo volume e tempo.
Com o término do experimento, os animais serão anestesiados com quetamina (80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg) e após verificação de ausência nos sinais de dor e perda de reflexo, os mesmos serão submetidos a coleta do lavado broncoalveolar. O experimento será finalizado com a remoção dos tecidos do coração e pulmões para serem realizadas avaliações de hipertrofia cardíaca e remodelamento pulmonar por análises histológicas.
Quantificação dos níveis do receptor solúvel da IL-33 (sST2)
Amostras de sangue serão coletadas por punção cardíaca em tubos com EDTA (100μM) e centrifugadas para separação do plasma. Feito isso, o plasma será utilizado para mensuração dos níveis do sST2 por kit de ELISA (Abcan 213871, Cambridge, UK) conforme recomendações do fabricante.
Lavado Broncoalveolar (BAL)
Após anestesia profunda por quetamina (80mg/kg) juntamente com xilazina (10mg/kg), os animais serão submetidos a punção cardíaca para coleta de sangue, posteriormente será coletado o lavado broncoalveolar, conforme descrito por Hoecke et al. (2017). Para isso, após constatada a perda dos reflexos de dor profunda os animais serão traqueostomizados. Será infundido 1mL de tampão fosfato + EDTA (100 uM) gelado pela traqueia do animal e imediatamente coletado por aspiração com a mesma seringa. O procedimento será repetido para coleta de 2 mL de BAL. Para análise das células do lavado broncoalveolar, as amostras serão centrifugadas em citocentrífuga (2000 rpm por 10 min) e coradas com May-Grünwald. Feito isso, serão analisadas em microscópio óptico com objetiva de 100x sob imersão por pesquisador experiente. A partir dos dados obtidos serão calculados os valores absolutos e relativos para cada tipo de célula.
Análises histológicas
O coração e os pulmões de uma parte dos animais serão fixados em formalina tamponada a 10%, processadas em concentrações crescentes de álcool e xilol e parafinados em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Feito isso, as amostras serão cortadas em seções de 3 μm (pulmão) e 4 μm (VD e VE) de espessura, fixadas em lâminas e coradas com tricrômico de masson, hematoxilina e eosina (HE) ou com picrosirius red para análise em microscópio (BRUCE et al., 2015; LI et al., 2013).
Análise de hipertrofia cardíaca
Os corações de uma parte dos animais será dissecado imediatamente após remoção para separar a parede livre do ventrículo direito do septo + ventrículo esquerdo. A análise de hipertrofia cardíaca será feita conforme descrito por Türck et al. (2018) onde o ventrículo direito será pesado e a tíbia da pata traseira direita do animal retirada.
Preparo das amostras para análise do estresse oxidativo
O pulmão e o ventrículo direito serão homogeneizados com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogenizer, OMNI International, EUA) na presença de 1,15% de KCl (5 ml/g de tecido) e 100 mM de fenilmetil sulfonil fluoreto. Feito isso, as amostras de tecido serão centrifugadas (20 minutos a 10000 x g a 4°C) e o sobrenadante será coletado e armazenado a -80 °C até o início das análises. A quantificação de proteínas será determinada conforme descrito pelo método de Lowry, usando solução de albumina de soro bovino como padrão (LOWRY et al., 1951).
Espécies reativas de oxigênio totais (EROs totais)
As EROs totais serão mensuradas pela oxidação do composto DCFH-DA (diacetato de 2,7-diclorofluoresceína) à DCF (2,7-diclorofluoresceína), conforme protocolo descrito previamente por LEBEL et al. (1992). Os resultados serão expressos como pmol de DCF/mg de proteína.
Sistema da glutationa
A análise do sistema da glutationa será mensurada pela razão entre a glutationa reduzida e a glutationa oxidada (GSH/GSSG) conforme descrito previamente por Akerboom e Sies, 1981. As amostras serão lidas em espectrofotômetro (412 nm) e os valores obtidos serão expressos em mmol/grama de tecido.
Sistema da tiorredoxina
Sistema Tiorredoxina
A análise do sistema da tiorredoxina será mensurada pela atividade da enzima tiorredoxina redutase e pela expressão gênica e proteica da tiorredoxina-1 (Trx-1) e da vitamina D3-proteína-1 regulada positivamente (VDUP-1) conforme descrito previamente por Zimmer et al. (2021).
Quantificação da expressão proteica por Western Blot
Amostras de pulmão e coração serão homogeneizadas e preparadas para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se o anticorpo primário IL-33, ST2, MyD88, NFkB e GAPDH (Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase). Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil).
Uma vez que a literatura apresenta variações na forma como induzir a HAP utilizando monocrotalina em camundongos, propomos a utilização de tempos distintos para a confirmação da eficácia do modelo em animais C57BL/6 de ambos os sexos. Diante disso utilizaremos a dose de 600 mg/Kg administrada por via intraperitoneal (RIBEIRO et al. 2017, SETA et al., 2011) durante 2, 4, 6 e 8 semanas consecutivas, com ou sem acompanhamento contínuo após indução. Serão utilizados 132 camundongos C57BL/6 (66 machos e 66 fêmeas) divididos em 11 grupos experimentais. Ao término do período experimental, eles serão subdivididos para análise do lavado broncoalveolar (n=6) e para coleta de sangue por punção cardíaca (n=6) para analisar os níveis do receptor do sST2/ IL33. Todos os animais serão advindos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas. Feito isso, será realizada a coleta e preparo dos tecidos do coração e pulmões para análises histológicas e bioquímicas.
Animais e grupos experimentais
1. Controle 2w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 3 ° semana experimental.
2. Monocrotalina- 2w - (MCT-2w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 3° semana experimental.
3. Monocrotalina- 2w - acompanhamento contínuo (MCT-2w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (totalizando 2 doses) e serão eutanasiados na 9 ° semana experimental.
4. Controle 4w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 5° semana experimental.
5. Monocrotalina- 4w - (MCT-4w): animais que receberão MCT animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 5° semana experimental.
6. Monocrotalina- 4w - acompanhamento contínuo (MCT-4w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas (totalizando 4 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
7. Controle 6w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 7° semana experimental.
8. Monocrotalina- 6w (MCT-6w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 7° semana experimental.
9. Monocrotalina- 6w - acompanhamento contínuo (MCT-6w-AC): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 6 semanas consecutivas (totalizando 6 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
10. Controle 8w: animais que receberão veículo (NaCl 0,9%) uma vez por semana durante 8 semanas consecutivas (totalizando 8 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
11. Monocrotalina- 8w (MCT-8w): animais que receberão monocrotalina (600mg/kg i.p.) uma vez por semana durante 8 semanas consecutivas (totalizando 8 doses) e serão eutanasiados na 9° semana experimental.
Experimento 2
Serão utilizados 48 camundongos C57BL/6 machos e fêmeas (60 dias) advindos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas, divididos em 4 grupos, que serão submetidos a indução à hipertensão arterial pulmonar por uso de monocrotalina na dose de 600 mg/ Kg, com tempo e via a ser confirmado após resultados do teste piloto.
1.Controle (CTRL): animais que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal e por gavagem intragástrica;
2.Pleurotus albidus (P.albidus): animais que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal e que serão tratados com extrato de P. albidus por gavagem intragástrica;
3.Monocrotalina (MCT): animais que receberão monocrotalina (600mg/Kg) (1 dose por semana), em tempo e via ainda a ser estabelecido após teste piloto, e que receberão solução salina (NaCl 0,9%) por gavagem intragástrica;
4.Monocrotalina + P. albidus (MCT-P.albidus): animais que receberão monocrotalina (600mg/Kg) (1 dose por semana), em tempo e via ainda a ser estabelecido após teste piloto, e que serão tratados com extrato de P. albidus por gavagem intragástrica;
O tratamento com extrato hidroalcoólico do cogumelo Pleurotus albidus terá início 24 horas após a primeira administração de monocrotalina e será realizado diariamente ao longo de todo período experimental. Para isso, o extrato de Pleurotus albidus liofilizado será diluído em água destilada e administrado 1 vez por dia (entre 16-17h) por gavagem intragástrica (500mg/kg) conforme descrito previamente por Da costa et al. (2021). Os animais dos grupos 1 e 3 passarão pelo mesmo procedimento de gavagem intragástrica, porém receberão apenas água destilada no mesmo volume e tempo.
Com o término do experimento, os animais serão anestesiados com quetamina (80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg) e após verificação de ausência nos sinais de dor e perda de reflexo, os mesmos serão submetidos a coleta do lavado broncoalveolar. O experimento será finalizado com a remoção dos tecidos do coração e pulmões para serem realizadas avaliações de hipertrofia cardíaca e remodelamento pulmonar por análises histológicas.
Quantificação dos níveis do receptor solúvel da IL-33 (sST2)
Amostras de sangue serão coletadas por punção cardíaca em tubos com EDTA (100μM) e centrifugadas para separação do plasma. Feito isso, o plasma será utilizado para mensuração dos níveis do sST2 por kit de ELISA (Abcan 213871, Cambridge, UK) conforme recomendações do fabricante.
Lavado Broncoalveolar (BAL)
Após anestesia profunda por quetamina (80mg/kg) juntamente com xilazina (10mg/kg), os animais serão submetidos a punção cardíaca para coleta de sangue, posteriormente será coletado o lavado broncoalveolar, conforme descrito por Hoecke et al. (2017). Para isso, após constatada a perda dos reflexos de dor profunda os animais serão traqueostomizados. Será infundido 1mL de tampão fosfato + EDTA (100 uM) gelado pela traqueia do animal e imediatamente coletado por aspiração com a mesma seringa. O procedimento será repetido para coleta de 2 mL de BAL. Para análise das células do lavado broncoalveolar, as amostras serão centrifugadas em citocentrífuga (2000 rpm por 10 min) e coradas com May-Grünwald. Feito isso, serão analisadas em microscópio óptico com objetiva de 100x sob imersão por pesquisador experiente. A partir dos dados obtidos serão calculados os valores absolutos e relativos para cada tipo de célula.
Análises histológicas
O coração e os pulmões de uma parte dos animais serão fixados em formalina tamponada a 10%, processadas em concentrações crescentes de álcool e xilol e parafinados em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Feito isso, as amostras serão cortadas em seções de 3 μm (pulmão) e 4 μm (VD e VE) de espessura, fixadas em lâminas e coradas com tricrômico de masson, hematoxilina e eosina (HE) ou com picrosirius red para análise em microscópio (BRUCE et al., 2015; LI et al., 2013).
Análise de hipertrofia cardíaca
Os corações de uma parte dos animais será dissecado imediatamente após remoção para separar a parede livre do ventrículo direito do septo + ventrículo esquerdo. A análise de hipertrofia cardíaca será feita conforme descrito por Türck et al. (2018) onde o ventrículo direito será pesado e a tíbia da pata traseira direita do animal retirada.
Preparo das amostras para análise do estresse oxidativo
O pulmão e o ventrículo direito serão homogeneizados com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogenizer, OMNI International, EUA) na presença de 1,15% de KCl (5 ml/g de tecido) e 100 mM de fenilmetil sulfonil fluoreto. Feito isso, as amostras de tecido serão centrifugadas (20 minutos a 10000 x g a 4°C) e o sobrenadante será coletado e armazenado a -80 °C até o início das análises. A quantificação de proteínas será determinada conforme descrito pelo método de Lowry, usando solução de albumina de soro bovino como padrão (LOWRY et al., 1951).
Espécies reativas de oxigênio totais (EROs totais)
As EROs totais serão mensuradas pela oxidação do composto DCFH-DA (diacetato de 2,7-diclorofluoresceína) à DCF (2,7-diclorofluoresceína), conforme protocolo descrito previamente por LEBEL et al. (1992). Os resultados serão expressos como pmol de DCF/mg de proteína.
Sistema da glutationa
A análise do sistema da glutationa será mensurada pela razão entre a glutationa reduzida e a glutationa oxidada (GSH/GSSG) conforme descrito previamente por Akerboom e Sies, 1981. As amostras serão lidas em espectrofotômetro (412 nm) e os valores obtidos serão expressos em mmol/grama de tecido.
Sistema da tiorredoxina
Sistema Tiorredoxina
A análise do sistema da tiorredoxina será mensurada pela atividade da enzima tiorredoxina redutase e pela expressão gênica e proteica da tiorredoxina-1 (Trx-1) e da vitamina D3-proteína-1 regulada positivamente (VDUP-1) conforme descrito previamente por Zimmer et al. (2021).
Quantificação da expressão proteica por Western Blot
Amostras de pulmão e coração serão homogeneizadas e preparadas para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se o anticorpo primário IL-33, ST2, MyD88, NFkB e GAPDH (Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase). Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil).
Indicadores, Metas e Resultados
Com a realização do presente projeto esperamos verificar os efeitos do extrato de P. albidus sobre parâmetros de estresse oxidativo, remodelamento pulmonar e hipertrofia cardíaca na HAP induzida por monocrotalina em camundongos.
Esperamos também avaliar os níveis do receptor solúvel da IL-33 e sua correlacionar esse com a inflamação presente na progressão da HAP induzida por monocrotalina em camundongos.
Esperamos também avaliar os níveis do receptor solúvel da IL-33 e sua correlacionar esse com a inflamação presente na progressão da HAP induzida por monocrotalina em camundongos.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| KAREN MARTIRENA MONKS DA SILVA | |||
| PAULO CAVALHEIRO SCHENKEL | 1 |