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Dado que a micróglia monitora continuamente o parênquima circundante para detectar alterações na função cerebral e está envolvida no controle da excitabilidade neuronal, atividade sináptica, neurogênese e depuração de células apoptóticas no cérebro adulto saudável, é de extrema relevância determinar como o T. gondii poderia modular a micróglia em doenças neurodegenerativas crônicas, como a DA, (Chen e Trapp, 2016; Wes et al., 2016). Assim, este estudo contribuirá não só na descoberta de imunomoduladores para a DA, como também na busca de moléculas derivadas de T. gondii e como elas podem evocar um fenótipo regulatório ou tolerogênico entre as células neuroimunes.
Por fim, justifica-se que a administração de moléculas derivadas de parasitas é considerada mais eficaz e segura para os seres humanos do que outros medicamentos imunomoduladores. No entanto, a maioria dos experimentos para investigar as funções das proteínas derivadas de parasitas, em termos de seus efeitos, envolveu modelos animais. Assim, os padrões de qualidade de produção e as dosagens eficazes das proteínas derivadas do parasita precisam ser confirmados. Além disso, os mecanismos precisos dessas proteínas-chave precisam ser mais explorados.

Para o estudo, serão utilizadas células da linhagem microglial BV-2 (código 0356) obtidas através do banco de células do Rio de Janeiro (BR) e cedida pelo Laboratório de Enzimologia Toxicológica da UFSM. As células serão cultivadas na densidade 2,5X105 em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma-Aldrich) modificado para conter 4 mM L-glutamina, 4500 mg/L de glicose, 1 mM de piruvato de sódio e 1500 mg/L de bicarbonato de sódio, 10% fetal bovino soro (Sigma-Aldrich) e 1% de penicilina/ estreptomicina (100 U/ mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) (Sigma-Aldrich) em condições ideais de crescimento (37ºC com 95% de oxigênio e 5% de CO2).

As células serão infectadas com cepa virulenta de T. gondii (Cepa RH na densidade de 1:10 parasitas/células) ou cepa cistogênica (ME-40, média de 5 cistos/célula). Ambas as cepas serão previamente irradiadas em luz UV por 30 minutos para inviabilizar o potencial patogênico do parasito. Após, serão adicionadas em meio de cultivo RPMI até o uso.

As culturas de células BV-2 serão pré-incubadas com o peptídeo b-amilóide (Ab, Sigma Aldrich) mediante curva concentração-tempo a ser definida por testes piloto durante o projeto antes da adição do T. gondii a fim de mimetizar o modelo de DA.

A taxa de proliferação celular será medida após incubação com 50 μmol/L de 5-bromo-2 desoxiuridina (BrdU, Sigma Aldrich), um análogo da timidina que se incorpora ao DNA durante a fase S do ciclo celular e pela marcação do DNA total com iodeto de propídio (IP) durante 30 minutos. O BrdU será adicionado ao meio de cultura na concentração final de 50 µmol/L e as células cultivadas por 30 minutos (para análise das fases do ciclo celular) ou 2 h (análise da proliferação celular). Após este período, as células serão dissociadas mecanicamente e fixadas com etanol 75%. A recuperação antigênica será realizada seguindo a fixação de células com PFA 4%. As células serão lavadas em PBS, e incubadas durante 2 h com anticorpo anti-BrdU (1:500, Sigma-Aldrich). Os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor-488 serão usados a 1:500 de diluição(Sigma-Aldrich). Após lavagem com PBS, solução DAPI (0,3 μg/mL, Sigma-Aldrich,) será utilizado como um corante nuclear. As análises serão obtidas por imunocitoquímica utilizando microscopia.
A viabilidade celular das células BV-2 serão analisada pelo método do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich). As células serão incubadas com 5 mg/mL de MTT durante 2 h a 37 °C sob 5% de CO2 e 95% de umidade. Após, para solubilização dos cristais de formazan, será adicionado dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma-Aldrich) e as absorbâncias serão lidas a 560 nm em leitor de microplacas. Os resultados serão expressos como porcentagens dos grupos controle não tratados.
5.5 Quantificação de proteína -amilóide e emaranhados neurofibrilares
As células BV-2 serão fixadas em 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min e, em seguida, bloqueadas/permeabilizadas em 3% de SFB, 0,1% de Triton X-100 durante 20 min, incubadas com anticorpos primários de proteína fibrilar ácida anti-glial (GFAP) (1:500, Sigma-Aldrich), anti-APP (1:500; Sigma-Aldrich). As imagens serão capturadas com câmera digital Nikon DXM1200F acoplada sob um microscópio de fluorescência (Axiovert 200, Zeiss). Os experimentos serão realizados em triplicatas e os dados calculados através do software Flowjo.

A quantificação extracelular de DNA de fita dupla (dsDNA) será determinada usando uma sonda fluorescente Quant-iT PicoGreen® dsDNA. Este reagente se liga ao dsDNA liberado no meio extracelular, indicando um parâmetro de dano celular ou lise [36]. A intensidade de fluorescência será determinada na excitação de 480 nm e na emissão de 520 nm usando um leitor de microplacas. Os resultados expressos como percentagem do controlo negativo (% de conteúdo de dsDNA livre).

A expressão gênica de citocinas pró e anti-inflamatórias será realizada em resposta à exposição ao T. gondii serão avaliadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR). O RNA será isolado utilizando o reagente TRIzol™ de acordo com o protocolo do fabricante e quantificado espectrofotometricamente (Thermo Scientific™ NanoDrop Lite). A síntese complementar de DNA (cDNA) será realizada utilizando o kit de síntese de cDNA iScript™ (Bio-Rad Laboratories) através de amplificação em termociclador: 25 °C por 5 min, 46 °C por 20 min e 95 °C por 1 min ou de acordo com fabricante. Os resultados serão apresentados como quantificação relativa do grupo controle. O gene da β-actina ou similar será utilizado como gene endógeno para normalização de dados.

As análises estatísticas dos dados serão realizadas em software GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, EUA). Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média utilizando a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. Diferenças significativas serão consideradas quando p<0.05.

Ao final deste estudo, espera-se:
- Demonstrar os efeitos diretos do T. gondii em modelo de DA utilizando células microgliais;
- Elucidar o potencial imunomodulador do T. gondii na micróglia ativada;
- Reduzir a taxa de emaranhados neurofibrilares e/ou p-tau em micróglia infectadas por T. gondii;
- Determinar a taxa de proliferação/morte celular induzidas por T.gondii no modelo de DA;-
- Entender o mecanismo supressivo das respostas imunes elicitadas pelo T. gondii na DA;
- Explorar o potencial supressivo das proteínas do parasito para induzir a imunomodulação;