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A regulação do tônus vascular tem sido foco de diversos estudos que objetivam a compreensão da patogênese e da fisiopatologia de doenças cardiovasculares (Abdullah S. et al., 2022). Neste contexto, o endotélio vascular exerce ação importante por estar diretamente envolvido na síntese e na secreção de substâncias vasoativas como, por exemplo, o óxido nítrico (NO) e a endotelina, moléculas que atuam na regulação do tônus vascular sob diferentes estímulos. A ação contrarregulatória desses e de outros agentes vasodilatadores e vasoconstritores determina a tensão do músculo liso vascular. Portanto, um desbalanço favorável aos constritores pode contribuir com a piora funcional e estar associado em doenças como o infarto agudo do miocárdio, isquemias transitórias, hipertensão arterial, hipertensão arterial pulmonar, dentre outras (Cerqueira, N. F et al., 2002).
O NO é um gás lipofílico sintetizado no endotélio vascular a partir da L-Arginina em condição de estresse mecânico exercido pelo fluxo de sangue local. A distorção mecânica das células endoteliais estimula a enzima óxido nítrico sintase (NOS) que produz NO e L-Citrulina. Cabe destacar que as células endoteliais também podem ser ativadas por estímulos químicos que interagem com receptores de membrana (Abdullah S. et al., 2022). Uma fez formado nas células endoteliais, o NO se difunde para as células musculares lisas vasculares para promover vasodilatação. Contudo, sua meia-vida é muito curta e ele é rapidamente metabolizado em nitrito e nitrato, formas mais estáveis e, portanto, mais fáceis de serem mensuradas (Lundberg et al., 2008).
A utilização desses metabólitos do NO com fins profiláticos e terapêuticos têm aumentado nos últimos anos e vem crescendo o número de trabalhos que demonstram seus efeitos vasodilatadores (Lundberg et al., 2008, Volino-Souza, M. et al., 2021, Cerqueira, N. F et al., 2002.
Quantidades relativamente pequenas de nitrito existem naturalmente nos alimentos e sua adição em carnes para conservação é bastante comum. A administração terapêutica de nitrito mostrou-se muito promissora em estudos pré-clínicos, tendo em vista sua ação vasodilatadora (Volino-Souza, M. et al., 2021). Em doenças que são caracterizadas por isquemia regional e vasoconstrição, o nitrito pode fornecer um doador de NO terapêutico ideal, estável e natural (Lundberg et al., 2008).
Já o nitrato é encontrado em grandes quantidades em vegetais de folhas verdes (por exemplo, espinafres e alface), bem como na beterraba (beterraba vermelha) (Mills et al., 2017). A beterraba (Beta vulgaris L.) é botanicamente classificada como uma herbácea bienal pertencente à família Chenopodiaceae e possui diversas variedades com cores de bulbos que variam do amarelo ao vermelho (Sileshi T et al., 2023). A beterraba vermelha (Beta vulgaris L.) Originária das regiões de clima temperado da Europa e Norte da África, caracterizada por possuir uma raiz tuberosa comestível, é cultivada primeiramente por causa de suas raízes, que possuem um alto valor nutricional e são usualmente consumidas depois de processadas (Lasta H, 2017). Elas exibem um alto potencial antioxidante, que está associado com o conteúdo do pigmento betalaína. As betalaínas são efetivas na captura de radicais livres (Lasta H, 2017).
O extrato de beterraba vermelha, um aditivo alimentar aprovado pela União Europeia (UE) (E251-Nitrato de sódio, E252-Nitrato de potássio), é uma importante fonte de NO, além de também apresentar propriedades antioxidantes, e tem sido testado in vitro e in vivo (Mills et al., 2017, Volino-Souza, M. et al 2023).
Tais benefícios à regulação do tônus vascular promovidos pela suplementação alimentar com determinados compostos bioativos parecem ser de extrema relevância em distúrbios isquêmicos permanentes ou transitórios. Esse último é conhecido como lesão de isquemia/reperfusão (IR) e consiste em duas fases. A primeira fase é caracterizada por isquemia, predomínio do metabolismo anaeróbico, acidose e formação de espécies reativas de oxigênio/nitrogênio (ERO e ERN). A segunda fase é caracterizada por reperfusão, reoxigenação e formação de grande quantidade de ERO e ERN, além de radicais livres desses elementos que favorecem o estresse oxidativo, condição associada com a disfunção endotelial (Wu MY et al., 2018).
No coração, a I/R pode desencadear várias consequências como, por exemplo, o aparecimento de arritmias cardíacas denominadas de stunned heart (coração atordoado) e/ou contraturas cardíacas denominadas stone heart (coração de pedra). Ambas as condições estão atreladas ao estresse oxidativo, especialmente ao aumento dos níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) e dos níveis de cálcio intracelular (Schenkel et al., 2010). Já nos vasos sanguíneos, a I/R promove prejuízo na regulação do tônus vascular local, na inibição da agregação plaquetária e na sinalização celular, distúrbios observados após infarto agudo do miocárdio, intervenção coronária percutânea (ICP) ou cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) (Saemann et al., 2023).
Dentre outras fontes de oxidantes que favorecem a condição de estresse oxidativo destacamos o sistema xantina oxidase, o sistema NADPH oxidase, a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e o sistema desacoplado do óxido nítrico sintase. O desacoplamento enzima NOS contribui adicionalmente na formação de EROs e ERN em detrimento do NO. A concentração de tetrahidrobiopterina (BH4), um cofator da NOS, desempenha um papel crítico na síntese de NO. A síntese de BH4 se dá a partir de ações enzimáticas, sendo destacada a enzima ciclohidrolase I (GTPCH). Sua atividade aumenta a produção de BH4 e, consequentemente, aumenta da biodisponibilidade de NO. Portanto, níveis mínimos de BH4 e GTPCH são fundamentais para produção de NO e manutenção da integridade dos vasos (Mills et al., 2017). Sua oxidação, observada em distúrbios como a I/R, desacopla a NOS e, assim, a enzima passa a sintetizar ânion radical superóxido ao invés de NO. Ou seja, o prejuízo se dá duplamente pela menor oferta do potente vasodilatador e pela formação de um radical livre de oxigênio (Mills et al., 2017). Portanto, o controle do estado redox celular contribui no funcionamento da NOS através do cofator BH4.
Portanto, amparados pelo potencial vasodilatador e antioxidante do extrato de beterraba, o presente projeto tem como objetivo principal avaliar se o extrato de beterraba exerce ações cardioprotetoras por promover vasodilatação de artérias aortas isoladas e por atenuar o estresse oxidativo no tecido cardíaco.

Nos experimentos de 1 a 3 os animais serão aclimatados ao ambiente do biotério e devidamente eutanasiados para realização dos testes de reatividade vascular com aneis de artéria aorta. No experimento 4 propomos a utilização dos corações dos animais do primeiro experimento para análise do potencial antioxidante in vitro do extrato de beterraba. Já no experimento 5, propomos a suplementação diária com extrato de beterraba na água de beber durante 21 dias ininterruptos. Para isso, o extrato será diluído em água destilada e ofertado ad libitum aos animais. Ao término da suplementação de 21 dias os animais serão devidamente eutanasiados para análise da reatividade vascular em artérias aortas e o coração pulmões e fígado serão coletados para análises histológicas e bioquímicas.

Eutanásia: Ao final do experimento, os animais serão anestesiados com isoflurano e eutanasiados por deslocamento cervical.

Análises histológicas
O coração e os pulmões dos animais serão fixados em formalina tamponada a 10%, processadas em concentrações crescentes de álcool e xilol e parafinizados em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Feito isso, as amostras serão cortadas em seções de 3 μm (pulmão) e 4 μm (VD e VE) de espessura, fixadas em lâminas e coradas com tricômito de masson, hematoxilina e eosina (HE) ou com picrosirius red para análise em microscópio por pesquisador experiente (BRUCE et al., 2015; LI et al., 2013). Serão mensurados os seguintes parâmetros: área dos cardiomiócitos, deposição de colágeno, infiltrado inflamatório e espessamento da parede dos vasos sanguíneos.

Análise bioquímica
Preparação dos tecidos
Amostras de pulmão e do ventrículo direito serão homogeneizados com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogeneizer, OMNI International, EUA) na presença de 1,15% de KCl (5 ml/g de tecido) e 100 mM de fenilmetil sulfonil fluoreto. Feito isso, as amostras serão centrifugadas (20 minutos a 10000 x g a 4°C) e o sobrenadante será coletado e armazenado a -80 °C até o início das análises (Zimmer, 2020).

Nitritos e Nitratos
Para a análise de nitrito e nitrato, o sobrenadante será diluído com a fase móvel (NOCARA, Eicom) e injetado em analisador de NOx ENO-20 (Eicom). Os níveis de nitrito e nitrato serão calculados por comparação com os resultados obtidos a partir de soluções padrão (NO-STD, Eicom).

Análise do ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Na análise das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), o sobrenadante será incubado por 45 min a 65°C com ácido tiobarbitúrico (TBA) em condições ácidas.
Espécies reativas de oxigênio totais (EROs totais)
As EROs totais serão mensuradas pela oxidação do composto DCFH-DA (diacetato de 2,7-diclorofluoresceína) à DCF (2,7-diclorofluoresceína), conforme protocolo descrito previamente por LEBEL et al. 1992. Os resultados serão expressos como pmol de DCF/mg de proteína.
Enzimas antioxidantes
Superóxido Dismutase (SOD)
A SOD é definida através da inibição da reação do radical superóxido com o pirogalol. A oxidação do pirogalol leva à formação de um produto colorido que é detectado pelo espectrofotômetro a 420nm. Os resultados serão expressos em U SOD/mg de proteína em comparação com uma curva de SOD padrão (SigmaAldrich, superóxido dismutase de bovino, pó liofilizado, ≥ 1500 unidades/mg de proteína) (Marklund, 1974).
Catalase (CAT)
A atividade da CAT será medida através do decréscimo na absorbância de H2O2 no comprimento de onda de 240nm. Será expressa em pmoles de H2O2 reduzidos/min/mg de proteína (Aebi, 1984).
Glutationa Peroxidase (GPx)
A atividade da GPx será avaliada através do consumo de NADPH na reação de redução acoplada à reação da GPx, o qual será medido por espectrofotômetro a um comprimento de onda de 340 nm. A atividade será expressa como nmol de peróxido/hidroperóxido reduzidos/min/mg de proteína (Flohé; Günzler, 1984).
Óxido Nítrico Sintase (NOS)
A atividade da enzima óxido nítrico sintase nos homogeneizados de pulmão será avaliada através da medida de conversão da oxihemoglobina (HbO2) induzida por óxido nítrico em metahemoglobina, sendo expresso em nmol NO/min/mg de proteína (Echer et al, 2019).
4.8.5.5 Atividade da NADPH oxidase
A NADPH oxidase através da transferência de elétrons do NADPH para o oxigênio molecular, provoca a geração de ânions superóxido. A atividade da enzima será determinada no homogeneizado de aortas medindo o consumo de NADPH a 340nm, sendo sua atividade diretamente proporcional à produção do ânion superóxido. Os resultados serão expressos em nmol/min/mg de proteína (WEI et al, 2006).

Avaliação do imunoconteúdo por Western Blot
Amostras de pulmão e coração serão homogeneizadas e preparadas para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se o anticorpo primário eNOS, SOD, CAT, gp91-phox, B-actina. Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil).]

Expressão gênica
As amostras dos animais serão imediatamente homogeneizadas em TRIzol (Ambion; Life Technologies, CA, USA) na concentração de 100 mg/mL. Para quantificação do RT-PCR, o RNA das amostras será extraído com Direct-zol RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, CA, USA). Então, será utilizado o kit Máxima First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific) e a expressão do mRNA será mensurada utilizando o reagente Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs). As amostras serão utilizadas quanto a expressão gênica de eNOS, SOD, CAT, gp91-phox, B-actina.


Descarte de materiais biológicos e químicos
As carcaças dos animais eutanasiados serão dispensadas em saco plástico fechado e depositados em bombonas, com tampa para recolhimento no Biotério Central da UFPEL, por empresa especializada. Materiais perfurocortantes que tenham contato com líquidos corpóreos dos animais, como agulhas e seringas, serão descartados em caixas de papelão amarela conforme protocolo do Ministério de Saúde. Materiais tóxicos e contaminados serão tratados conforme protocolo da instituição.

Análise estatística
Para determinação da normalidade será utilizado o teste de Shapiro-Wilk. Se os dados apresentarem distribuição normal de variância homogênea, será utilizada análise de variância (ANOVA) sequencial seguida do pós-teste de Bonferroni para detectar diferença significativa entre os grupos (quando P<0,05). Caso o conjunto dos dados não apresente distribuição normal, os mesmos serão analisados por testes estatísticos não paramétricos. Para as análises de reatividade vascular, será utilizado teste t, seguido do teste F para detectar diferença significativa entre os grupos (P<0,05). As análises serão realizadas usando o software GraphPad Prism 8.0.

Com a realização do projeto esperamos determinar a influência do extrato de beterraba num modelo in vitro de isquemia-reperfusão, explorando os mecanismos envolvidos na possível proteção cardiovascular exercida pelo composto. Junto a isso, almejamos formar uma rede de pesquisa junto ao Prof. Thiago da Silveira Alvares do PPGMCF da UFRJ-Macaé, e ao pesquisador Rogério Nogueira Soares da Wayne State University em Detroit/EUA, visando a complementação de técnicas analíticas e ampliação das oportunidades de consolidar parcerias entre grupos de pesquisa a nível Nacional e Internacional (internacionalização). Desta forma, estaremos formando recursos humanos qualificados e fortalecendo a linha de pesquisa.