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A resistência antimicrobiana representa uma das principais ameaças à saúde pública mundial do século XXI (WHO, 2015). Predições indicam que 2,4 milhões de pessoas morrerão de infecções por microrganismos resistentes nos próximos 30 anos somente nos continentes da Europa, América do Norte e Austrália, podendo custar até US$ 3,5 bilhões por ano (OECD, 2018). Além disso, é previsto que no ano de 2050 as mortes causadas por resistência aos antimicrobianos mundialmente chegariam a 10 milhões (GHOSH et al.2019).
Apesar do desenvolvimento da resistência antimicrobiana ser inevitável, já que é um processo natural evolutivo, esse evento foi agravado devido à pressão seletiva impulsionada principalmente por conta do mau uso das drogas antimicrobianas. Dentre essas práticas pode-se citar o uso excessivo de antibióticos, o não cumprimento do tratamento da forma recomendada e a prescrição inapropriada por parte de profissionais da saúde (VENTOLA, 2015). Além disso, o uso de antibióticos no setor da agricultura, que envolve uso veterinário e em plantas, também contribui bastante para o desenvolvimento da resistência antimicrobiana (SARKAR et al., 2018).
Nesse contexto, um grupo de patógenos, denominado ESKAPE, causa grande preocupação. Composto pelas espécies Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp., essas bactérias são as principais responsáveis por infecções relacionadas ao atendimento em saúde (IRAS) e apresentam resistência a diversos tipos de antibióticos (MULANI et al., 2019).
Os mecanismos de resistência apresentados por esses patógenos podem ser agrupados em inativação ou alteração da molécula antimicrobiana, modificações no local alvo da bactéria, penetração ou acumulação reduzida de antibióticos e a formação de biofilmes bacterianos (DE OLIVEIRA et al., 2020). São exemplos de resistência comumente encontrados entre as bactérias desse grupo: Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Escherichia coli produtora de β-lactamase de espectro estendido(ESBL) e Enterococcus resistente à vancomicina (VRE) (MUKHOPADHYAY et al., 2020).
Dado o grande risco que a resistência antimicrobiana representa, a Organização Mundial da Saúde publicou uma lista de 12 bactérias, incluindo patógenos do grupo ESKAPE, para o qual é necessário se desenvolver novos antimicrobianos com urgência. Assim, as bactérias Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosae Enterobacteriaceae foram listadas como prioridade crítica; enquanto Enterococcus faecium e Staphylococcus aureus, como prioridade alta (WHO, 2017).
Atualmente, uma das alternativas mais promissoras no tratamento contra microrganismos resistentes são os peptídeos antimicrobianos (PAMs). Essas moléculas são expressas por essencialmente todos os organismos vivos, sendo responsáveis pela primeira linha de defesa contra a infecção por patógenos, eliminando-os e aumentando a resposta imune (HANEY et al., 2017;MISHRA et al., 2017). Os PAMs mostram um amplo espectro de atividades antimicrobianas, atuando contra bactérias, parasitas, vírus e fungos. Além disso, devido ao alvo principal de ação dos PAMs serem as membranas celulares e não um processo de biossíntese do microrganismo, eles são considerados uma opção para reduzir a chance de desenvolvimento de resistência (GHOSH & HALDAR, 2015).
Novos produtos antimicrobianos, incluindo PAMs, podem ser descobertos isolando-os de uma fonte natural. No entanto, este caminho clássico para descobrir novas moléculas não é adequado para o processo de escalonamento, uma vez que pode ser demorado, ter baixo rendimento e alto custo de produção (BOTO; PÉREZ DE LA LASTRA;GONZÁLEZ, 2018). Além disso, os PAMs de ocorrência natural podem possuir algumas características indesejáveis a sua aplicação terapêutica, como instabilidade devido à degradação por proteases do hospedeiro, baixa seletividade, baixa hidrossolubilidade, atividade hemolítica, toxicidade do hospedeiro e sensibilidade ao sal (BOTO; PÉREZ DE LALASTRA; GONZÁLEZ, 2018).
A fim de superar essas desvantagens, tem-se como alternativa os peptídeos antimicrobianos sintéticos. Essas moléculas são produzidas com base no desenho racional que relaciona estrutura com a atividade dessas moléculas, uma vez que cada aminoácido é adicionado sequencialmente ao PAM, sendo possível fazer modificações pontuais, analisando e otimizando essas moléculas (HANEY; MANSOUR; HANCOCK, 2017; ONG;WIRADHARMA; YANG, 2014).
Recentemente, oito peptídeos antimicrobianos sintéticos, racionalmente desenhados baseados em proteínas vegetais, demonstraram resultados promissores e com potencial para serem utilizados como tratamento antimicrobiano alternativo para substituir ou complementar os já existentes. São eles: Mo-CBP3-PepI, Mo-CBP3-PepII e Mo-CBP3-PepIII (OLIVEIRA et al., 2019); RcAlb-PepI, RcAlb-PepII e RcAlb-PepIII (DIAS et al., 2020); e PepGAT e PepKAA (SOUZA et al., 2020).
Estudos anteriores demonstraram que os peptídeos não apresentam toxicidade para os tipos A, B e O de eritrócitos humanos ou para linhagem de células Vero em concentrações de 500 μg mL-1 (Dias et al., 2020; Lima et al. al., 2020; Oliveira et al., 2019; Souza et al., 2020). Além disso, esses peptídeos não apresentam toxicidade para outras células humanas, como fibroblastos (linhagens L929 e MRC-5) e queratinócitos (HaCat) (dados não mostrados, manuscrito em preparação). Em relação à alergenicidade, nenhum dos peptídeos apresentou potencial alergênico quando analisados em bases de dados de epítopos primários alérgicos conhecidos (Dias et al., 2020; Oliveira et al., 2019; Souza et al., 2020).
Esses peptídeos possuem potente atividade antifúngica contra Candida spp. (LIMA et al., 2020), Tricophyton rubrum e T. mentagrophytes (LIMA; SOUZA; et al., 2021; SOUZA et al., 2020) e Penicillium digitatum(LIMA; FREITAS; et al., 2021). Além disso, eles também demonstraram possuir ação contra bactérias, como Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae (OLIVEIRA et al., 2019; DIAS et al., 2020). No entanto, mais estudos são necessários para acessar o potencial desses PAMs sintéticos contra bactérias patogênicas relevantes.

Desenho dos peptídeos
Os peptídeos foram projetados conforme descrito por OLIVEIRA et al. (2019), DIAS et al. (2020) e (SOUZA et al., 2020), empregando a sequência de aminoácidos das proteínas Mo-CBP3 (GIFONI et al., 2012), Rc-2SAlb (SOUZA et al., 2016) e uma quitinase (LIN et al., 1999), usando o software CePAmP de acesso gratuito (http://bioserver-3.bioacademy.gr/Bioserver/C-PAmP/Peptide_index.php). Os peptídeos tiveram que cumprir os seguintes critérios: carga líquida positiva; baixa massa molecular (600-1200 Da); índice de Boman ≤ 2,5; pelo menos 40% de potencial hidrofóbico. Esses critérios foram avaliados usando a ferramenta Banco de dados de peptídeos antimicrobianos (http://aps.unmc.edu/AP/).

Atividade antibacteriana
Os peptídeos serão testados inicialmente em uma concentração padrão de 50 mg.mL-1 contra as bactérias Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. As atividades antimicrobianas consideradas mais promissoras terão sua concentração inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM) determinadas. A CIM será determinada através da Técnica de Microdiluição em Caldo emplacas de poliestireno como estabelecido pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2018). Serão feitas diluições de razão dois dos peptídeos em Caldo BHI (Brain and Hearth Infusion – Kasvi®) e, em seguida, serão adicionados 50 μL do inóculo bacteriano preparado a partir de suspensão em solução salina (1,5x108 UFC/mL) o qual será diluído em caldo BHI (1:20). Como controles serão utilizados o meio de cultivo, meio de cultivo acrescido do inóculo bacteriano e DMSO 5%. As placas serão incubadas a 36°C por 24h. Os testes serão realizados em triplicata com três repetições para cada isolado utilizado no estudo. Após o período de incubação será feita a adição de 10μL do corante revelador Resazurina (Sigma-Aldrich ®) em todas as cavidades da placa e posteriormente será incubado a 36°C por 2h. Após isso, o surgimento da coloração rosa indicará possível viabilidade celular bacteriana, sendo possível determinar a CIM.
Com base nos resultados que serão obtidos na CIM, a partir dos poços em que houve inibição do crescimento bacteriano, será coletada uma alçada para repique em Ágar BHI (Kasvi®). Após o período de incubação, será verificado em quais concentrações as moléculas apresentaram ação bactericida, indicada pela ausência do crescimento bacteriano (CLSI, 2018).

Ensaio de tempo de morte bacteriana (Time-Kill Assay)
A curva de morte será determinada de acordo com a metodologia proposta por DANIEL-JAMBUN et al. (2019). Para tal, suspensões bacterianas (106 UFC/mL) obtidas a partir de cultura recente (18-24h) serão submetidas a diferentes concentrações de petídeos, conforme determinado na CIM, sendo elas 0,5xCIM, 1xCIM, 2xCIM e 4xCIM em 5mL de caldo BHI (Kasvi®). A partir disso, serão retirados 100 μL dos poços testes para realização de diluições seriadas e plaqueamento em Ágar BHI a fim de contar ascélulas viáveis e determinar o número de UFCs. As coletas para esta determinação serão feitas nos tempos 0 min, 15 min, 30 min, 2h, 4h, 8h, 24h e 48h e ou até ser observada a ausência de células viáveis.

Mecanismo de ação dos PAMs na célula bacteriana
Alteração da morfologia celular bacteriana
Para observar alterações na morfologia celular será utilizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV). As células bacterianas serão submetidas as concentrações dos PAMs previamente determinadas nos testes anteriores, serão centrifugadas, lavadas com PBS (Phosphate-bufferid saline 0,1 M) três vezes e desidratadas em concentrações crescentes de etanol (30%, 50%, 80%, 90% e 100%).Após, ele será substituído por álcool butílico (Sigma®) e em seguida as amostras serão revestidas por partículas de ouro e submetidas a MEV (LI et al., 2019).

Permeabilidade da membrana
A permeabilidade da membrana celular será determinada através da condutividade elétrica relativa segundo DIAO et al. (2014) com auxílio de condutivímetro (HANNA® – HI98311). Para tal, serão utilizados cultivos de 10h dos isolados bacterianos em estudo, os quais serão centrifugados a 5.000 x g por 10 min, posteriormente o pellet será lavado com uma solução de glicose 5% (Synth ®) até a condutividade elétrica ficar semelhante à da glicose. Posteriormente serão adicionadas concentrações de peptídeos definidas anteriormente e incubadas por 8h a 37°C, sendo denominado tratamento L2.Concomitante ao tratamento L2 será realizado o L1, que corresponderá as concentrações das moléculas na solução de glicose 5% (ausência do pellet) e tratamento L0, que será o pellet em solução de glicose 5% (sem molécula) após fervura por 5 min. A permeabilidade da membrana será calculada através da variação no percentual da condutividade elétrica (V%) de acordo com a equação: V% = (L2-L1/L0) x100.

Integridade da membrana celular e extravasamento de ácidos nucléicos
A integridade da membrana celular será determinada pela detecção de componentes celulares no sobrenadante conforme descrito por DIAO et al. (2014). A partir de cultura recente dos isolados bacterianos em BHI (Kasvi ®) (18-24h) será feita a centrifugação das mesmas por 1 min a 5.000 × g e posteriormente, será realizada lavagem com água destilada estéril, e serão suspendidas em 100 mL de PBS, as quais serão tratadas com concentrações de PAMs determinadas anteriormente, sendo incubada por 4h a 37°C. Posteriormente será feita a análise do sobrenadante para proteínas (BRADFORD, 1976) e para açúcares redutores em espectrofotômetro (MILLER, 1959). Para análise de ácidos nucléicos, o sobrenadante será submetido a espectrofotometria de UV a 260nm, sendo os controles PBS e PBS acrescido das concentrações de peptídeos.
Além disso, as células bacterianas tratadas serão coradas com LIVE/DEAD™ Viability/Cytotoxicity Kit (Thermo Scientific). A visualização das células será feita no microscópio confocal Leica TCS SP8.

Determinação da concentração inibitória e bactericida mínima do biofilme (CIMB e CBMB)
Para determinar a CIMB e CBMB será utilizada a metodologia proposta por CAFISO et. al (2010) e adaptada por Reiter et. al (2012). Para isso serão preparados inóculos bacterianos (1,5x108 UFC/mL) de cultura recente (18-24h) dos micro-organismos em estudo e a partir disso, será adicionado 20μL do mesmo em 180μL de Caldo Trypcase Soy Broth (TSB, Acumedia ®), sendo incubado por 24h a 36°C. Após o período de incubação, as células não aderidas serão removidas e as placas serão lavadas cuidadosamente com solução salina estéril três vezes. Posteriormente será adicionado o meio de cultura com as diluições das moléculas mencionadas anteriormente e incubadas nas mesmas condições. A CIM será considerada como a concentração da molécula em que não será observado crescimento visível.
Para determinar a CBMB será removido o caldo TSB com as diferentes concentrações das moléculas e em seguida será adicionado 100μL do meio de cultura, sendo incubado 24h a 36°C. A CBMB será considerada como a menor concentração em que a bactéria não crescerá após a exposição à concentração das moléculas, impedindo a formação de biofilme. Os testes serão feitos em triplicata.

Ensaio de sinergismo
O efeito sinérgico entre os peptídeos e antibióticos comerciais será analisado de acordo com LU et al. (2018). O inóculo bacteriano será preparado e o ensaio será realizado conforme descrito anteriormente. Todas as concentrações de antibiótico e peptídeos serão testadas sozinhas e combinadas. Os dados serão analisados para calcular o índice de concentração inibitória fracionária (ICIF). Os valores de ICIF indicarão se a interação entre as substâncias é antagonista (ICIF ≥4,0), indiferente (ICIF 0,5-4,0) ou sinérgica (ICIF ≤0,5).

Testar ação antibacteriana de oito peptídeos sintéticos contra seis espécies de bactérias patogênicas, avaliando a possibilidade de sugerir o uso desses peptídeos como novas drogas antibacterianas ou como terapia combinada a drogas já existentes.