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Esperamos com este estudo elucidar a relação entre helmintos e pacientes oncológicos, abrindo novas perspectivas para o tratamento e melhora na qualidade de vida desta população. Assim como, observar o impacto gerado no sistema imunológico de gestantes, revelando como ocorre o sistema de evasão destes nematódeos e se esta relação pode trazer riscos à gestante ao seu feto.
Além disso, esta pesquisa irá fornecer subsídios para médicos responsáveis pelo tratamento de doenças oncológicas sobre a necessidade do tratamento profilático com anti-helmínticos como metodologia padrão para todos os pacientes, ou se a prevalência de pacientes infectados nestes grupos é pequena e, assim, não justificando a utilização de medicamentos prévios no seu controle.
Em adição a estas observações, será realizada a avaliação de coinfecções entre os diversos geohelmintos. Correlacionando com os dados coletados em questionário como idade, sexo e as categorias incluídas neste estudo.
Todos os resultados obtidos serão amplamente divulgados na comunidade acadêmica por meio de artigos científicos de alto impacto e para a sociedade em geral através de PITCH (material de divulgação em vídeo voltado ao público leigo), sempre respeitando o sigilo dos pacientes.

4.1.Grupos populacionais
Os pacientes incluídos neste estudo serão compostos por pessoas atendidas pelo Hospital Escola da Universidade Federal de Pelotas (HE-UFPel) na cidade de Pelotas, Rio grande do Sul. A população incluída na pesquisa será de 100 indivíduos portadores de doenças oncológicas, 100 gestantes e um grupo controle que será formado por indivíduos livres de doenças crônicas e autoimunes contendo também 100 indivíduos.
4.2.Aspectos éticos
Serão incluídas neste estudo amostras de indivíduos livres de doenças crônicas e autoimunes, gestantes e pacientes oncológicos triados e selecionados pelo serviço de atendimento do Hospital Escola da Universidade Federal de Pelotas (HE-UFPel). As pessoas com mais de 18 anos de idade e que aceitarem o convite para participar da pesquisa, após serem entrevistadas, deverão assinar o TCLE - termo de consentimento livre e esclarecido, aceitando a doação das amostras para inclusão no estudo. Os pacientes com idade entre 6 e 18 anos, que aceitarem o convite para participar da pesquisa, deverão assentir o TALE - Termo de Assentimento Livre e Esclarecido, assim como seus responsáveis serão convidados também a assinar o TCLE para responsáveis. O TALE foi elaborado em linguagem acessível para os menores ou para os legalmente incapazes, por meio do qual, após os participantes da pesquisa serem devidamente esclarecidos, explicitarão sua anuência em participar da pesquisa, sem prejuízo do consentimento de seus responsáveis legais. Para todos os indivíduos que aceitarem participar da pesquisa será aplicado um questionário simples e de fácil entendimento visando obter dados básico como faixa etária e informações específicas como região e cidade de sua moradia, profissão, renda familiar, contato com animais e utilização de anti-helmínticos.
Este projeto foi enviado ao CEP (Comitê de Ética em Pesquisa) via Plataforma Brasil e aguarda parecer favorável para sua execução.
4.3.Obtenção e codificação das amostras
Serão obtidas amostras de sangue de todos os indivíduos incluídos nos grupos experimentais (oncológicos e gestantes) e grupo controle (indivíduos livres de doenças crônicas e autoimunes). As amostras de sangue serão coletadas em tubos sem a presença
de anticoagulante em um volume aproximado de 4mL. A partir deste será obtido o soro o qual será identificado e dividido em duas alíquotas de volume aproximado de 500 μL e mantidas à -20ºC para análises imunológicas. Outro tubo para coleta de sangue será utilizado, este com anticoagulante para obtenção de sangue total.
4.4.Detecção de Imunoglobulina
Todas as amostras serão submetidas ao teste de imunodiagnóstico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) indireto (Engvall & Perlmann, 1972 com modificações), buscando identificar anticorpos do tipo Imunoglobulina G (IgG) sérica total e Imunoglobulina E (IgE) sérica total para os parasitos Toxocara canis, Ascaris lumbricoides, ancilostomídeos, tricurídeos e Strongyloides spp.. Serão realizados quatro ensaios individuais por parasito para cada amostra. Destes, dois serão realizados para detecção de IgG e IgE utilizando peptídeos sintéticos e dois da mesma forma para peptídeos naturais.
Para a detecção de IgG, todas as amostras serão avaliadas em duplicatas utilizando o anticorpo secundário anti-IgG humana (Invitrogen - Anti-Human-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal, HPR/A18805). Nas análises de IgE o ensaio será desenvolvido da mesma forma, porém utilizando o anticorpo secundário anti-IgE humano (Anti-Human IgE (ε-chain specific)−Peroxidase antibody produced in goat). Resumidamente, os poços das placas serão previamente sensibilizados (1ug/poço) com antígeno referente ao parasito a ser avaliado diluído em tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6), os poços serão bloqueados com 5% de leite desnatado diluído em PBS com 0,05% de Tween® 20 e então as amostras de soro diluídas serão adicionadas. Será adicionada anti-IgG conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Reações colorimétricas serão obtidas com 1 mg / mL de OPD (o-Phenylenediamine) e 1 μL / mL de H2O2 diluído em tampão citrato-fosfato, pH 5,0. A reação será parada com H2SO4 4N. A absorbância será determinada a 492 nm utilizando um leitor de microplacas (BIOTEK). Entre cada etapa, as placas serão lavadas quatro vezes com PBS contendo Tween® 20 a 0,05%. Os resultados serão expressos como a média OD492 e o Cut Off obtido pelo cálculo de 3 vezes a média dos soros negativos. A concentração de soro e antígeno utilizada para cada parasito será baseada nas referências citadas a seguir, possíveis ajustes que se façam necessários serão realizados por padronização por titulação cruzada.
Para a realização destes ensaios imunoenzimáticos com peptídeos sintéticos, as placas serão sensibilizadas com peptídeos sintéticos preditos como epítopos de células B. Cada peptídeo sintético é composto por 15 aminoácidos preditos como epítopos lineares exclusivos de cada patógeno e desenvolvidos para detecção específica de imunoglobulinas. Essas moléculas encontram-se patenteadas sobre o registro BR 10 2023 027792 6 e foram desenvolvidas pelo Laboratório de Imunobiologia e Controle de Parasitos (LICP) do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e parceiros.
Para a pesquisa de imunoglobulinas utilizando peptídeos nativos produzidos diretamente do parasito serão utilizadas metodologias distintas para cada um deles. Na identificação sorológica de IgG e IgE anti-Toxocara canis será utilizado o antígeno de excreção e secreção (TES) de Toxocara canis a partir do sobrenadante do cultivo de larvas deste parasito e os soros testes serão previamente adsorvidos com antígeno somático de Ascaris lumbricoides na concentração de 23,7 μg/mL por 1h para evitar reação cruzada
entre estes ascarideos. Este antígeno será utilizado na concentração de 1 μg/mL e o soro na diluição de 1/100 (Schoenardie et al., 2013).
Para a observação sorológica de IgG e IgE anti-Ascaris lumbricoides, as placas de teste serão adsorvidas com antígeno somático de Ascaris lumbricoides na concentração de 10 μg/poço e os soros dos pacientes serão testados na diluição de 1/64 (Bhattacharyya et al., 2001). A detecção sorológica de IgG e IgE anti-ancilostomídeos será realizada com o antígeno de excreção e secreção (E/S) de Ancylostoma ceylanicum a partir do sobrenadante do cultivo de larvas filarioides (L3) deste parasito. O antígeno será utilizado na concentração de 150 μg/mL e o soro na diluição de 1/100 (Shetty et al., 1988).
Na identificação sorológica de IgG e IgE anti-Strongyloides spp. será utilizado o antígeno de excreção e secreção (E/S) de larvas filarioides Strongyloides venezuelensis a partir do sobrenadante do cultivo de larvas deste parasito. O antígeno será utilizado na concentração de 5 μg/mL e o soro na diluição de 1/80 (Gonzaga et al., 2011).
A detecção de IgG e IgE anti-Trichuris spp. será realizada com o antígeno de excreção (E/S) de Trichuris muris a partir do sobrenadante do cultivo de adultos deste parasito. A concentração do antígeno será de 5 μg/mL e a diluição do soro de 1/160 (Blackwell & Else, 2002; Else et al., 1989).
4.5.Quantificação sérica de interleucinas
Para análise de citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IL-17, será utilizado soro dos pacientes e dos controles de forma individual em duplicatas. A quantificação de citocinas no soro de pacientes será realizada conforme as instruções do fabricante (BD Biosciences, EUA) por meio da técnica de ELISA de captura. Primeiramente as placas de 96 poços de alta afinidade serão sensibilizadas com o anticorpo de captura diluído em solução estoque coating buffer (carbonato de sódio 0,1M, pH 9,5 incubadas por 18 horas) a 4°C. Logo após, as placas serão lavadas com wash buffer (tampão salina fosfato acrescido de 0,05 % de Tween). Em seguida, será adicionado o tampão diluente (tampão salina fosfato com 10% de soro fetal bovino, Sigma-Aldrich) por 60 minutos a temperatura ambiente. As amostras de soro serão então adicionadas nas placas por 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente as placas de alta afinidade serão lavadas e então acrescidos os anticorpos de detecção (1:250). Depois disso, as placas serão lavadas e acrescidas do complexo estreptavidina-peroxidase (1:250). Por fim a reação será revelada com TMB (BD Bioscience) por 15 minutos, seguido de solução de parada (H2SO4, 2N). A leitura será realizada a 450nm em espectrofotômetro de microplacas. Os resultados serão calculados através da curva padrão do teste em software específico.
4.6.Análises estatísticas
Os resultados obtidos por ELISA indireto para Toxocara canis, Ascaris lumbricoides, ancilostomídeos, tricurídeos e Strongyloides spp. serão comparados entre os grupos de pacientes oncológicos, gestantes e também frente da população livre de doenças. Para isso, os dados serão submetidos à análise de variância e as médias serão comparadas pelo teste de Tukey (p < 0.05), utilizando o software GraphPad-Prismversão 8.0. A mesma comparação entre grupos será realizada para as Interleucinas IL-4, IL-10,
IL-12 e IL-17. Os resultados de ELISA indireto de peptídeos totais e sintéticos também serão analisados usando o software Medical Calculators Ink 2019 (versão 18.9), para determinar a área sob a curva receiver operating characteristic (ROC) e a sensibilidade e especificidade das técnicas para o diagnóstico.

Realizar testes imunológicos para detecção de Imunoglobulina G (IgG) e Imunoglobulina E (IgE) sérica total utilizando peptídeos, produzidos diretamente dos parasitos e outros produzidos de forma sintética, anti-Toxocara canis, anti-Ascaris lumbricoides, anti-Ancylostoma spp., anti-Necator americanus, anti-Strongyloides stercoralis e anti-Trichuris trichiura em amostras de soro dos pacientes oncológicos, gestantes e população livre de doenças crônicas e autoimunes;
Aplicar questionário visando identificar fatores epidemiológicos de risco para a infecção por geohelmintos;
Comparar a sensibilidade e especificidade entre peptídeos nativos e sintéticos de geohelmintos para imunodiagnóstico;
Quantificar a expressão de Interleucinas IL-4, IL-10, IL-12 e IL-17;
Avaliar estatisticamente os resultados obtidos nos diferentes ensaios para o diagnóstico de geohelmintos em humanos;
Relatar a existência de coinfecções nos diferentes grupos estudados;
Divulgar amplamente os resultados deste estudo. Realizar a publicação de artigos científicos em revistas de alto impacto para informar a comunidade acadêmica e elaborar PITCH (vídeo de curta duração em linguagem simples) para o esclarecimento da população.