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A leptospirose, zoonose bacteriana, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, apresenta ampla distribuição global, estando ausente apenas no Ártico e Antártica (COSTA et al., 2015). A doença afeta especialmente populações economicamente vulneráveis de países de clima tropical e subtropical. No âmbito da saúde pública, estima-se que anualmente ocorram ~1,03 milhão de casos, dos quais resultam em um total de cerca de 2,90 milhões de Anos de Vida Ajustados por Incapacidade (DALYs, na sigla em inglês) (TORGERSON et al., 2015). No setor veterinário, a doença é uma das causas primárias associada a significativas perdas econômicas decorrentes de desordens reprodutivas em animais de pecuária (GOMES et al., 2022). Rebanhos bovinos, suínos, ovinos e caprinos cronicamente infectados podem apresentar elevadas taxas de abordos, natimortos e disfunções do ciclo estral (LOUREIRO; LILENBAUM, 2020; MARTINS; LILENBAUM, 2014). No setor pet, os cães são os animais mais acometidos pela infecção por leptospiras, que podem ser mantidas nos rins e eliminadas pela urina e outros fluidos corporais, tornando-os uma potencial fonte de infecção para humanos (DI AZEVEDO et al., 2023). Nestes animais, as manifestações clínicas podem variar de infecção crônica e assintomática a doença aguda e grave (DE OLIVEIRA et al., 2022; SYKES et al., 2023).
Vacinas inativadas (bacterinas) são mundialmente aplicadas em cães e animais de produção como principal medida de controle da doença. No entanto, relatos de ensaios de análise de eficácia encontrados na literatura apontam dados de eficácia variável destas formulações (FÁVERO et al., 2018; KLAASEN et al., 2022; SONADA et al., 2018; SUEPAUL et al., 2010). Um estudo recente (BERGMANN ESTEVES et al., 2022) demonstrou que as bacterinas comerciais para o controle da leptospirose canina apresentam ~84% de eficácia contra a doença clínica e 88% contra o status de portador renal. Esses níveis de proteção demonstram-se inconsistentes em diversas marcas de vacinas. A curta duração dos níveis de anticorpos induzidos pela vacinação torna necessária a aplicação de reforços semestrais em regiões endêmicas para a doença. Adicionalmente, as vacinas atualmente disponíveis no mercado não são capazes de eliminar completamente as leptospiras dos rins dos animais infectados, tal falha permite que a bactéria seja excretada no ambiente através da urina, permitindo com que animais infectados sigam como portadores assintomáticos (BERNARDUS et al., 2022; DE OLIVEIRA et al., 2021; KLAASEN et al., 2022; MARTINS; OLIVEIRA; LILENBAUM, 2018; SONADA et al., 2018; SUEPAUL et al., 2010). Essas limitações deixam uma lacuna no mercado veterinário para que empresas do setor invistam em Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (P&DI), visando a obtenção de vacinas mais efetivas para o controle desta doença.
Atualmente são descritas 69 espécies genômicas dentro do gênero Leptospira, das quais 20 são classificadas como patogênicas (FERNANDES et al., 2022; KORBA et al., 2021; VINCENT et al., 2019). Adicionalmente, leptospiras são classificadas sorologicamente com base na composição de lipopolissacarídeos da superfície celular, sendo atualmente reconhecidos 260 sorovares classificados como patogênicos (ADLER; MOCTEZUMA, 2010; VINCENT et al., 2019). Visto a grade diversidade de espécies e sorovares existentes destas bactérias, uma etapa crucial para o desenvolvimento de vacinas para a leptospirose é a manutenção de um banco de cepas de Leptospira bem caracterizado. O grupo de pesquisa em Vacinologia, vinculado ao Núcleo de Biotecnologia da UFPel possui mais de 20 anos de experiência na pesquisa para o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos para a leptospirose, bem como na caracterização molecular de cepas de Leptospira spp. Baseados nisso, nesse projeto propomos realizar a caracterização genética de bancos de cepas de Leptospira de empresas parceiras do mercado de saúde animal, que apresentem interesse no desenvolvimento de formulações vacinais para o controle da leptospirose animal. Este projeto será desenvolvido através de um contrato entre a empresa e a UFPel, em uma modalidade de prestação de serviços técnicos.
Por fim, cabe ressaltar que a manutenção de um banco de cepas destinadas a produção de vacinas caracterizado geneticamente é fundamental para as empresas de vacinas por diversas razões:
• Assegurar a segurança e controle de qualidade: a análise genética ajuda a garantir que as cepas utilizadas não sofram mutações que possam comprometer a segurança ou eficácia da vacina. A caracterização genética regular permite o monitoramento de eventuais variações, mantendo o controle de qualidade e a consistência entre lotes de vacinas.
• Compliance regulatória: A caracterização genética é muitas vezes um requisito de órgãos reguladores para o registro e comercialização de vacinas. Manter o banco atualizado e caracterizado assegura que a empresa cumpra com as exigências legais, acelerando o processo de aprovação de novas vacinas ou versões melhoradas.

Obtenção e cultivo das cepas:
As cepas de Leptospira spp. serão fornecidas pelas empresas parceiras através de contratos com a UFPel. Após recebimento no Laboratório de Vacinologia, todas as cepas serão cultivadas em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco; BD, Brasil) líquido enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco, BD, Brasil) e 1% de 5-Fluorouracil, seguido de incubação a 30 °C durante 7-10 dias.

Avaliação da pureza e cinética de crescimento das cepas:
O crescimento e pureza das culturas será acompanhado através de análise em microscopia de campo escuro. Após assegurada a pureza e ausência de outros contaminantes como fungos e bactérias, culturas em fase exponencial de crescimento serão expandidas em meio líquido, conforme descrito anteriormente. Após atingirem a fase exponencial de crescimento (~1-2×108 células/mL) parte das culturas será utilizada para produção de sementes a serem estocadas em nitrogênio líquido (com adição de 2,5% de DMSO).

Caracterização genética das cepas vacinais:
Cultivos das cepas mantidos em meio EMJH em fase exponencial (~1-2×108 células/mL) serão utilizados para extração de DNA genômico utilizando o kit Bacteria genomicPrep Mini Spin Kit (Cytiva), seguindo protocolo recomendado para bactérias Gram negativas. Após a extração a qualidade das amostras de DNA será analisada por eletroforese em gel de agarose, seguida de quantificação por fluorometria (Qubit® - Invitrogen) e análise da pureza por espectrofotometria (NanoVue – GE Heathcare). Amostras serão acondicionadas a -20 °C até o processamento. O DNA obtido será utilizado para análise de Variable-number Tandem Repeats (VNTR) realizado com sete primers discriminatórios previamente descritos (MAJED et al., 2005), flanqueando os locis VNTR4, VNTR7, VNTR9, VNTR10, VNTR11, VNTR19 e VNTR23. DNA genômico de cepas Leptospira já caracterizadas serão utilizados como controles positivos. Os amplicons serão avaliados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e o número de repetições será estimado por comparação.
Adicionalmente, uma fração de cada DNA genômico extraído será enviada a uma unidade especializada para realização de sequenciamento em plataforma de nova geração (NGS). Após o sequenciamento todos os dados serão analisados por bioinformatas especializados do Núcleo de Biotecnologia da UFPel. A tipagem molecular in silico dos isolados será realizada utilizando a aplicação mlst (https://github.com/tseemann/mlst) a partir dos esquemas de Multi Locus Sequence Typing (MLST) para Leptospira disponíveis no banco de dados PubMLST (https://pubmlst.org/). Além disso, uma análise de Average Nucleotide Identity (ANI) será realizada de modo a se identificar os genomas disponíveis no GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) mais próximos ao genoma de cada cepa sequenciada.

Elaboração de relatório:
Os dados obtidos com a caracterização genética das cepas de Leptospira analisadas serão compilados na forma de um relatório técnico-científico o qual será disponibilizado a empresa parceira após a conclusão do projeto.

Este projeto fará parte de um contrato de prestação de serviços firmado com empresas parceiras, mais especificamente indústrias que gerem produtos para o setor veterinário, as quais irão fornecer amostras de cepas de Leptospira conforme descrito na metodologia. Como resultado, esperamos contribuir com nossa experiência para a realização de uma etapa crucial para o desenvolvimento de novas formulações vacinais para atender o mercado. Por fim, este estudo também permitirá o treinamento e formação de mão de obra qualificada de estudantes de graduação e pós-graduação e a consolidação desta área de pesquisa junto à UFPel.