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A Conferência das Nações Unidas sobre Mudanças Climáticas (COP21) teve como principal enfoque a necessidade de reduzir as mudanças climáticas mundiais. Dentre as principais propostas para frear o aumento das temperaturas, está a diminuição do consumo de combustíveis fósseis, impelindo os países a adotar ações que primam por um desenvolvimento mais sustentável. Essa compreensão vai ao encontro dos Objetivos para o Desenvolvimento Sustentável, estabelecidos em 2016, também pela Organização das Nações Unidas. O conceito de sustentabilidade está intimamente ligado ao da inovação, que abrange a criação de novos produtos, processos, serviços, tecnologias, práticas organizacionais ou modelos de negócios. A aplicação da inovação à sustentabilidade é fundamental para a melhoria do desempenho sustentável, pois impulsiona a demanda por produtos que sejam fabricados de maneira mais eficiente e que consumam menos matérias-primas e recursos naturais, como água, petróleo e solo. Esse interesse crescente por práticas sustentáveis tem gerado uma demanda significativa por materiais de origem renovável e ecologicamente corretos. Existem alternativas bioplásticas para quase todos os materiais plásticos convencionais e suas aplicações, devido ao forte desenvolvimento de polímeros biodegradáveis e os de base biológica, como o ácido polilático (PLA), os polihidroxialcanoatos (PHA), o polietileno furanoato de base biológica (PEF) e o polipropileno (PP) de base biológica. O poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)] é sintetizado por diversos microrganismos e apresenta grande relevância, sendo empregue na produção de: materiais descartáveis e luvas, implantes e para a liberação controlada de drogas; embalagens para alimentos e embalagens “inteligentes”, usadas nas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmética. Entretanto, a produção do P(3HB) encontra desafios econômicos, tecnológicos e biológicos a serem superados. O Grupo de Pesquisa em Tecnologia de Bioprocessos (TecBio) produziu uma revisão bibliográfica que elenca as diferentes técnicas fermentativas utilizadas em estudos, dentre as quais: otimização dos parâmetros operacionais; uso de resíduos agroindustriais como fonte de carbono; produção conjunta de outros produtos de valor agregado, em forma de biorrefinaria; bioprospecção de novos microrganismos que apresentem produtividade elevada; fermentação em estado sólido, a qual apresenta as variações com hidrólise enzimática dos substratos; e mais recentemente, as pesquisas que utilizam consórcio microbiano, co-cultura ou culturas mistas. Recentes pesquisas avaliam consósrcio de microrganimsos para a otimização do processo de obtenção do bioplástico. Dentre os benefícios de se utilizar um consórcio microbiano está a redução de carga metabólica, o que pode aumentar a produtividade do processo. Para possibilitar novas aplicações ao P(3HB) e seus copolímeros, é propício realizar mudanças que melhorem e/ou modifiquem suas propriedades. Dentre as possíveis modificações, tem-se a coloração do PHB a partir de corantes naturais ou sintéticos. Atualmente, a demanda mundial tem priorizado os corantes naturais, visto que estes são tidos como mais seguros e apresentam produção de menor impacto ambiental, sendo uma alternativa “verde” na produção de corantes. Os corantes podem exercer papel de proteção para a estrutura do PHB e seus copolímeros. Assim, pode-se sugerir que as modificações químicas e visuais a que são suscetíveis os bioplásticos quando combinados com corantes podem ser atrativas comercialmente, para o meio ambiente e para os consumidores. O Grupo de Pesquisa TecBio tem se dedicado nos últimos anos à pesquisa e desenvolvimento de inovações relacionadas à coloração de bioplásticos biodegradáveis, especialmente P(3HB). Visando contribuir com os estudos referentes a diminuição dos custos da produção dos bioplásticos coloridos, o Grupo de Pesquisa em Tecnologia de Bioprocessos (TecBio) desenvolveu uma inovadora metodologia de coloração, que foi submetida a um pedido de depósito de patente no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI), sob o número de registro BR1020230033091. Entretanto, o campo de pesquisa e desenvolvimento Polihidroxialcanoatos coloridos ainda é recente, além do baixo número de estudos até então, motivo que justifica a pesquisa porposta.

Cepas bacterianas e meios de cultivo utilizados na fermentação: As linhagens das bactérias que serão estudadas fazem parte da coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Tecnologia de Bioprocessos da Universidade Federal de Pelotas, mantidas sob liofilização. Os microrganismos serão submetidos a repiques multiplicativos em Nutritive Yeast Agar (NYA) Peptona: 5 g/L (Kasvi®); Extrato de Levedura: 1 g/L (Kasvi®); Extrato de Carne: 3 g/L (Kasvi®); Glicose: 5 g/L (Neon®); Agar: 14 g/L (Dinâmica®)] (Schaad et al., 2001, modificado). Para o processo fermentativo, na fase de multiplicação celular, serão utilizados os meios de cultivo Yeast Malt (YM) [Extrato de Malte: 2,7 g/L (Kasvi®); Extrato de Levedura: 2,7 g/L (Kasvi®); Peptona: 4,5 g/L (Kasvi®) e Sacarose: 35 g/L com pH ajustado para 6; e na fase de acúmulo o meio mineral (MM) [Cloreto de cálcio: 0,02 g/L (Kasvi®); Fosfato de potássio monobásico: 1,5 g/L (Kasvi®); Fosfato de sódio: 4,5 g/L (Synth®); Sulfato de amônio: 1,5 g/L (Synth®); Sulfato de magnésio: 0,2 g/L (Synth®)] acrescido de 1 mL de solução de elementos-traço [Sulfato de magnésio: 0,2 g/L (Synth®); Cloreto de cálcio: 0,01 g/L (Kasvi®); Molibdato de sódio: 0,005 g/L (Synth®); Cloreto férrico: 0,05 g/L (Synth®)] com pH ajustado para 7 e 16 mL de Sacarose (40 g/L).

Processo fermentativo em agitador orbital e extração do polímero: A produção de filmes de P(3HB) colorido será realizada em duas etapas. A fase de multiplicação celular segue o protocolo desenvolvido no pedido de depósito de patente BR1020230033091 e a recuperação do bioplástico será realizada seguindo metodologia de Macagnan (2014) modificada.

Corante orgânico natural urucum: Para obtenção do corante em pó, sementes de urucum (X Roots®) serão secas em estufa a 28 °C, moídas em moedor de café (modelo MCG111ER, KitchenAid®) e o pó obtido será separado em diferentes granulometrias por tamisação com peneiras da série Tyler. A concentração do corante utilizado será de 3 g/L, com adição prévia à esterilização dos meios de cultivo.

Seleção das bactérias que produzem filmes de P(3HB) colorido e desenvolvimento do consórcio bacteriano para aumento da produção de filmes P(3HB) colorido em agitador orbital
Na primeira etapa serão testadas cinco espécies de bactérias, isoladamente na produção de filmes de P(3HB) coloridos utilizando a nova tecnologia de fermentação. Como controle, será realizado o processo fermentativo sem adição do corante. Amostras serão retiradas nos tempos de fermentação de 0 h e 72 h. Conforme resultados obtidos, as bactérias que produzirem filmes de P(3HB) coloridos serão utilizadas para a seleção de consórcio bacteriano.

Análise da influência do corante natural urucum no crescimento celular e no acúmulo de P(3HB)
A massa celular seca (MCS) será obtida por gravimetria de volatilização. O acúmulo de P(3HB) será calculado a partir da pesagem dos filmes obtidos para o cálculo do rendimento, que será expresso em porcentagem, de acordo com a equação 1, abaixo:
%R = (P1 ÷P2) ✕ 100 Equação 1
Em que: P1 é o peso total do filme colorido recuperado e P2 é a massa celular seca.

Determinação macroestrutural de cor: Para a análise macroestrutural da cor obtida após a inserção do corante, serão realizados dois testes nos filmes. Para a análise visual serão registradas fotografias em Fotodocumentador para gel de eletroforese LPix Image HE (Loccus Biotechnology®).
Fotodegradação simulada: Será realizada em estufa de fotoperíodo (ELETROLab, Modelo EL202), seguindo as normas da Sociedade Americana de Testes e Materiais (14.04, 2021) para Operação de Aparelhos de Lâmpadas Ultravioleta Fluorescente (UV) Para Exposição de Materiais Não Metálicos (ASTM G154-16).
Solução que mimetiza água marinha: Seguindo protocolo adaptado de Teste de Solidez da cor à água do mar para têxteis (AATCC 106-2013; ISO 105-E02:2013)
Azeite de oliva e óleo mineral: De acordo com a norma “Métodos de teste para migração total em azeite por imersão total” (EN 1186-2:2002) para análise de plásticos em contato com alimentos (CEN, 2002)
Ângulo de contato: O ângulo de contato é determinado a partir do método de gota séssil (Neumann; Good, 1972).
Calorimetria exploratória diferencial (DSC): Será realizada em analisador Pyris 6 (Perkin Elmer, Waltham, EUA).
Microscopia eletrônica de varredura (MEV): A análise da superfície dos filmes de P(3HB) corados e do controle será feita por micrografias das amostras que serão obtidas em microscópio eletrônico de varredura (MEV, Jeol, JSM - 6610LV, EUA), equipado com microssonda de espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX).
Análise estatística: São utilizados os softwares Microsoft Office 365 Excel para cálculo de médias e desvio padrão das triplicatas e GraphPad Prism 8 produção de gráficos e para análise estatística utilizando de Tukey (ANOVA) com p ≤ 0,05.

A metodologia de inserção de corantes naturais ao processo fermentativo submerso de microrganismo que naturalmente sintetiza o poli(3-hidroxibutirato) é inovadora, pois diminui o número de etapas necessárias à obtenção do bioplástico colorido. Da mesma forma, a produção a partir de um consórcio de microrganismos mostra-se promissora, pois apresenta características metabólicas e de resistência diferenciadas das monoculturas, além de apresentar o potencial para otimização do processo e, portanto, de solucionar problemas de produção na escala industrial.
Assim, ambas as metodologias combinadas podem afetar diretamente nos custos para produção dos bioplásticos coloridos, gerando impacto financeiro positivo para a indústria, o que irá possibilitar baratear o processo produtivo e, consequentemente, uma maior acessibilidade de uso para o consumidor. Além disso, o uso combinado dessas metodologias é capaz de auxiliar na diminuição do impacto ambiental negativo dos processo de produção, já que diminui o número de etapas e reagentes para a obtenção do produto, contribuindo para para o cumprimento das ODS.
Como resultado deste projeto, é esperado a obtenção de P(3HB) colorido a partir da inserção do corante natural urucum ao processo fermentativo submerso de microrganismo(s) que naturalmente produz(em) P(3HB), além da caracterização das propriedades físico-químicas, mecânicas e térmicas dos materiais obtidos. Desse modo, as análises a serem realizadas no presente projeto visam definir as possibilidades de aplicação destes bioplásticos coloridos a partir de suas propriedades. A partir deste estudo, por fim, visa produzir uma tese de doutorado e divulgar os resultados obtidos através da produção de artigos de alto impacto e a apresentação dos resultados em eventos científicos a nível regional e nacional, qualificando novos pesquisadores.