Nome do Projeto
Efeitos crônicos da 17α-metiltestosterona sobre parâmetros somáticos e reprodutivos de Cnesterodon decemmaculatus (Pisces:Poeciliinae)
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
31/01/2026 - 30/06/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Os impactos antrópicos sobre os ecossistemas aquáticos são uma problemática persistente. Entre suas principais repercussões está o aumento das concentrações de contaminantes e poluentes nesses ambientes. Uma das classes de contaminantes emergentes são os desreguladores endócrinos, amplamente distribuídos em corpos d’água nas concentrações de ng/L e µg/L. Esses compostos possuem a capacidade de modular respostas endócrinas via ações antagônicas ou agônicas, através do seu mimetismo a hormônios endógenos. Seus efeitos reconhecidos sobre a ictiofauna incluem alterações somáticas, reprodutivas e histológicas. Os andrógenos são esteroides com efeito primário masculinizante, além de serem precursores da produção de estrógenos. Quando livres no ambiente, podem ocasionar efeitos como a masculinização de fêmeas ou feminilização de machos em teleósteos. Essa classe hormonal recebeu pouca atenção ao longo dos anos em detrimento dos estrógenos. Atualmente, a presença de substâncias androgênicas tem ganhado espaço no cenário ecotoxicológico, trazendo uma nova perspectiva sobre o rol de riscos e danos ecológicos a serem avaliados. A 17α-metiltestosterona é um andrógeno sintético empregado na piscicultura e medicina. Seu uso reflete níveis detectáveis em efluentes, corpos d’água próximos e tanques de criação de peixes. Seus efeitos englobam a redução de parâmetros somáticos, a hipermasculinazação de machos, masculinização de fêmeas, a tendência à proporção sexual enviesada em favor de machos fenotípicos e anormalidades hepáticas e gonadais. Uma das espécies bioindicadoras sensíveis a contaminantes e com características que a tornam um bom modelo em estudos ecotoxicológicos é a Cnesterodon decemmaculatus (Pisces: Poeciliidae). A espécie apresenta marcado dimorfismo e plasticidade sexual fenotípica, o que a caracteriza como bioindicadora sensível a desreguladores endócrinos. Considerando os efeitos reconhecidos do andrógeno apresentado e a possível inédita avaliação desses efeitos na espécie supracitada, levantou-se a hipótese da ocorrência de ação masculinizante sobre os indivíduos fora levantada. Assim, o presente estudo busca analisar biomarcadores somáticos, reprodutivos, histológicos e populacionais evidenciados por alterações pós-exposição crônica (90 dias) de neonatos a concentrações ambientalmente realísticas de 17α-metiltestosterona (10, 50 e 100 ng/L).
Objetivo Geral
Objetivos gerais: Análise de efeitos da exposição crônica (90 dias) de indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona em parâmetros somáticos, reprodutivos e histológicos.
Objetivos específicos: Análise e comparação de biomarcadores somáticos como o comprimento padrão, peso, índice hepatossomático, índice gonadossomático e Fator de Condição de Fulton em indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores reprodutivos de índice de espessamento, índice de alongamento e índice de crescimento do gonopódio em machos e índice de masculinização em fêmeas de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores histopatológicos do fígado e gônadas de indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores de exposição em nível populacional com o cálculo da proporção entre machos e fêmeas e das taxas de mortalidade com indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Objetivos específicos: Análise e comparação de biomarcadores somáticos como o comprimento padrão, peso, índice hepatossomático, índice gonadossomático e Fator de Condição de Fulton em indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores reprodutivos de índice de espessamento, índice de alongamento e índice de crescimento do gonopódio em machos e índice de masculinização em fêmeas de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores histopatológicos do fígado e gônadas de indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Análise e comparação de biomarcadores de exposição em nível populacional com o cálculo da proporção entre machos e fêmeas e das taxas de mortalidade com indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a três concentrações (10, 50 e 100 ng/L) de 17α-metiltestosterona durante 90 dias.
Justificativa
Há décadas os ecossistemas aquáticos são alvos da contaminação que decorre das ações humanas. Os desenvolvimentos social, urbano e industrial são problemáticas intrínsecas aos níveis de contaminação e poluição reportados em ambientes aquáticos ao redor do globo (Nolorbe-Payahua et al., 2020; Vidal et al., 2018). Como consequência, danos ambientais associados à redução da qualidade da água e mudanças na sua composição físico-química e biológica e implicações que ecoam sobre a saúde dos organismos ali presentes, como as tendências de redução das suas performances e sobrevivências ocasionadas por alterações fisiológicas e funcionais, são observados (Arias et al., 2007; Batista, Ferreira & Silva, 2024; Nolorbe-Payahua et al., 2020; Yancheva et al., 2015).
Dentre as classes de contaminantes emergentes que tem recebido atenção crescente nos últimos anos, estão os desreguladores endócrinos (DE) (Young et al., 2017). Os DE são definidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como quaisquer substâncias ou misturas com capacidade de modulação do sistema endócrino que possam provocar efeitos deletérios sobre um organismo, sua prole ou população (Bila & Dezotti, 2007). Seus mecanismos de ação podem ser classificados como agônicos ou antagônicos, sendo os primeiros elucidantes de respostas via ligação aos receptores hormonais, enquanto os segundos bloqueadores dessas mesmas respostas via acoplamento ao receptor e consequente inibição da ação de seu ligante natural (Orn et al., 2003; Shenoy, 2012) ocasionando a disfunção do sistema endócrino (Filho, Santos e Vieira, 2007.
Dessa maneira, surge a preocupação crescente acerca das repercussões dos desreguladores endócrinos sobre organismos e a busca pelo reconhecimento dessas e de suas características. Contudo, a maioria dessas emprega em bioensaios apenas substâncias com potencial estrogênico (Angus et al., 2001). O enfoque nessa classe resulta de anos de levantamentos das suas concentrações no ambiente, sendo essas resultantes da excreção de estrogênicos pelos vertebrados e das décadas de uso de fármacos que apresentam em sua composição o 17α-etinilestradiol, um hormônio sintético com alta capacidade de desregulação (Bila & Dezotti, 2007). Em contrapartida, estudos recentes concluem que cerca de 96,5 % dos químicos desreguladores encontrados em afluentes e efluentes de estações de tratamento (ETA) da China pertencem a classe dos andrógenos e progestagênios (Chang et al., 2011). No meio aquático a exposição a contaminantes é um fator quase onipresente, e a habitação de localidades contaminadas impõe sobre esses organismos uma condição crônica de exposição a essas substâncias. É reconhecido, por fim, que o contato contínuo com desreguladores pode induzir fenômenos de anormalidades somáticas, histológicas e reprodutivas em peixes (Hou et al., 2018; Huang et al., 2024).
Um dos andrógenos em ascensão é a 17α-metiltestosterona (MT), um esteroide sintético derivado da metilação da testosterona. O composto é empregado na aquicultura como reversor sexual masculino e na medicina no tratamento de deficiências hormonais em homens e, secundariamente, como agente antineoplástico no tratamento de estágios avançados do câncer de mama em mulheres. Relatos de concentrações variáveis de MT em corpos d’água próximos a estações de tratamento de água nos Estados Unidos da América (250 ng/L), em águas de efluentes urbanos na China (4,1 a 7 ng/L) e em lagos e tanques destinados à piscicultura (6,8 a 39,3 ug/L) emergem na atualidade (Huang et al., 2024; Li et al., 2025; Thanasupsin, Chheang & Math, 2021). Ao mesmo passo que pesquisas expõem danos associados a concentrações tão baixas quanto 1 ng/L e 4,5 ng/L (Huang et al., 2024). Quando elevadas as concentrações aos níveis de 25 e 50 ng/L, são suscitadas tendências na proporção sexual direcionadas ao desenvolvimento de machos fenotípicos, de decréscimos nos valores de comprimento, peso e fator de condição e de desenvolvimento precoce de machos e masculinização em fêmeas (Huang et al., 2024; Orn et al., 2003).
Uma das espécies de peixes amplamente distribuída em sistemas de água doce da América do Sul e comumente empregada na análise de biomarcadores de exposição e efeito ocasionados por contaminantes e poluentes é a Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842) (Lucinda, 2005; Zambrano et al., 2018). Quando empregadas como objeto de estudo, é comum que as espécies sejam selecionadas com base na facilidade de manutenção em biotério e sensibilidade a tóxicos (Sparling, 2016). Essas características são encontradas e atribuídas, junto a sua alta tolerância a contrastantes condições ambientais, sua fácil aclimatação, sua abundância, sua ampla distribuição e ao seu estilo de vida não-migratório, à C. decemmaculatus, corroborando seu papel no cenário científico como bioindicadora e sentinela (Ossana et al., 2019; Young et al., 2017; Young et al., 2020; Zambrano et al., 2018; Zambrano et al., 2024).
O gênero Cnesterodon pertence à subfamília Poeciliinae (Cyprinodontiformes, Poeciliidae), caracterizada pelas sinapomorfias de viviparidade, fecundação interna e desenvolvimento de uma estrutura copulatória própria dos machos (Lucinda, 2003). O gonopódio, como é denominada a estrutura, auxilia na transferência espermática ao poro urogenital das fêmeas durante a cópula e se origina a partir do alongamento e fusão dos terceiro, quarto e quinto raios anteriores da nadadeira anal (Vidal et al., 2018; Wolff et al., 2007; Young et al., 2017). Quando nascidos, ambos sexos apresentam uma nadadeira idêntica (Tian et al., 2020), contudo, ao longo do seu desenvolvimento, as fêmeas crescem proporcionalmente a essa, enquanto os machos são sujeitos a uma série de modificações organogênicas andrógeno-dependentes que a diferenciam como corpo do gonopódio (Ogino, Katoh & Yamada, 2004). Sendo essencial à reprodução dos representantes da subfamília, o órgão é considerado um exímio biomarcador de exposição a desreguladores endócrinos, dada sua sensibilidade a presença de xenobióticos e seu caráter dimórfico e esteroide-dependente (Tian et al., 2020).
Sendo assim, é recorrente a análise de índices relacionados à morfologia reprodutiva dos Poeciliinae em ensaios de exposição. A avaliação desses só é possível devido a alterações decorrentes de disfunções endócrinas sobre o processo organogênico em questão (Angus et al., 2001). Young et al., (2020) relatam a inibição do desenvolvimento gonopodial de machos de C. decemmaculatus expostos ao 17α-etinilestradiol, enquanto Vidal et al., (2018) em seu estudo de áreas antropizadas relataram a formação de estruturas similares ao gonopódio em fêmeas da mesma espécie, efeito que fora associado pelos autores a possível presença de substâncias andrógenas.
Ao nível individual, além da análise de biomarcadores reprodutivos, é comum o emprego da aferência de índices e fatores de condição, além da quantificação de alterações histológicas em órgãos-alvo (Huang et al., 2024). Os parâmetros somáticos refletem repercussões negativas sobre o crescimento e desenvolvimento dos animais, sendo que a avaliação dos índices de condição hepatossomático e gonadossomático viabilizam a identificação e quantificação de acometimentos hepáticos e gonadais que os desreguladores possam desencadear, aumentando a ocorrência de desordens metabólicas, imunes, hormonais e gametogênicas (Li et al., 2025). Já os fatores de condição corpórea são empregados na determinação do status fisiológico dos animais, sendo o Fator de Condição de Fulton (K) baseado na premissa de que indivíduos de maior peso em determinado comprimento se encontram em melhores condições de saúde (Arias et al., 2007; Monaco, Suárez & Lima Junior, 2014).
No que tange a quantificação e alterações histopatológicas, cabe ressaltar que essas determinam de maneira semiquantitativa a presença de anormalidades em órgãos-alvo a partir da examinação de tecidos em microscopia (Yancheva et al., 2016). O estudo da histopatologia do fígado permite a identificação de danos passíveis de ocasionarem deficiências nutricionais e desordens metabólicas, afetando a fisiologia dos animais e sua capacidade de desintoxicação natural e armazenamento de energia, bem como suas funções imunes (Li et al., 2025; Ossana et al., 2019). Enquanto isso, o estudo histológico das gônadas qualifica anormalidades reprodutivas.
Ao fim e ao cabo, considerando que o conhecimento acerca de efeitos de substâncias androgênicas sobre a ictiofauna ainda é pouco entendido e buscado em pesquisas ecotoxicológicas (Huang et al., 2024), que os efeitos da exposição a um mesmo xenobiótico pode ser variável entre espécies e que organismos aquáticos são naturalmente expostos a concentrações subletais de forma contínua a contaminantes e poluentes (Bonifacio et al., 2016), justifica-se o presente estudo. O objetivo desse é a análise de biomarcadores somáticos, reprodutivos e histológicos em indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a um desregulador endócrino (17α-metiltestosterona) durante 90 dias a partir do seu nascimento a concentrações ambientalmente relevantes do composto (10, 50 e 100 ng/L).
Dentre as classes de contaminantes emergentes que tem recebido atenção crescente nos últimos anos, estão os desreguladores endócrinos (DE) (Young et al., 2017). Os DE são definidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como quaisquer substâncias ou misturas com capacidade de modulação do sistema endócrino que possam provocar efeitos deletérios sobre um organismo, sua prole ou população (Bila & Dezotti, 2007). Seus mecanismos de ação podem ser classificados como agônicos ou antagônicos, sendo os primeiros elucidantes de respostas via ligação aos receptores hormonais, enquanto os segundos bloqueadores dessas mesmas respostas via acoplamento ao receptor e consequente inibição da ação de seu ligante natural (Orn et al., 2003; Shenoy, 2012) ocasionando a disfunção do sistema endócrino (Filho, Santos e Vieira, 2007.
Dessa maneira, surge a preocupação crescente acerca das repercussões dos desreguladores endócrinos sobre organismos e a busca pelo reconhecimento dessas e de suas características. Contudo, a maioria dessas emprega em bioensaios apenas substâncias com potencial estrogênico (Angus et al., 2001). O enfoque nessa classe resulta de anos de levantamentos das suas concentrações no ambiente, sendo essas resultantes da excreção de estrogênicos pelos vertebrados e das décadas de uso de fármacos que apresentam em sua composição o 17α-etinilestradiol, um hormônio sintético com alta capacidade de desregulação (Bila & Dezotti, 2007). Em contrapartida, estudos recentes concluem que cerca de 96,5 % dos químicos desreguladores encontrados em afluentes e efluentes de estações de tratamento (ETA) da China pertencem a classe dos andrógenos e progestagênios (Chang et al., 2011). No meio aquático a exposição a contaminantes é um fator quase onipresente, e a habitação de localidades contaminadas impõe sobre esses organismos uma condição crônica de exposição a essas substâncias. É reconhecido, por fim, que o contato contínuo com desreguladores pode induzir fenômenos de anormalidades somáticas, histológicas e reprodutivas em peixes (Hou et al., 2018; Huang et al., 2024).
Um dos andrógenos em ascensão é a 17α-metiltestosterona (MT), um esteroide sintético derivado da metilação da testosterona. O composto é empregado na aquicultura como reversor sexual masculino e na medicina no tratamento de deficiências hormonais em homens e, secundariamente, como agente antineoplástico no tratamento de estágios avançados do câncer de mama em mulheres. Relatos de concentrações variáveis de MT em corpos d’água próximos a estações de tratamento de água nos Estados Unidos da América (250 ng/L), em águas de efluentes urbanos na China (4,1 a 7 ng/L) e em lagos e tanques destinados à piscicultura (6,8 a 39,3 ug/L) emergem na atualidade (Huang et al., 2024; Li et al., 2025; Thanasupsin, Chheang & Math, 2021). Ao mesmo passo que pesquisas expõem danos associados a concentrações tão baixas quanto 1 ng/L e 4,5 ng/L (Huang et al., 2024). Quando elevadas as concentrações aos níveis de 25 e 50 ng/L, são suscitadas tendências na proporção sexual direcionadas ao desenvolvimento de machos fenotípicos, de decréscimos nos valores de comprimento, peso e fator de condição e de desenvolvimento precoce de machos e masculinização em fêmeas (Huang et al., 2024; Orn et al., 2003).
Uma das espécies de peixes amplamente distribuída em sistemas de água doce da América do Sul e comumente empregada na análise de biomarcadores de exposição e efeito ocasionados por contaminantes e poluentes é a Cnesterodon decemmaculatus (Jenyns, 1842) (Lucinda, 2005; Zambrano et al., 2018). Quando empregadas como objeto de estudo, é comum que as espécies sejam selecionadas com base na facilidade de manutenção em biotério e sensibilidade a tóxicos (Sparling, 2016). Essas características são encontradas e atribuídas, junto a sua alta tolerância a contrastantes condições ambientais, sua fácil aclimatação, sua abundância, sua ampla distribuição e ao seu estilo de vida não-migratório, à C. decemmaculatus, corroborando seu papel no cenário científico como bioindicadora e sentinela (Ossana et al., 2019; Young et al., 2017; Young et al., 2020; Zambrano et al., 2018; Zambrano et al., 2024).
O gênero Cnesterodon pertence à subfamília Poeciliinae (Cyprinodontiformes, Poeciliidae), caracterizada pelas sinapomorfias de viviparidade, fecundação interna e desenvolvimento de uma estrutura copulatória própria dos machos (Lucinda, 2003). O gonopódio, como é denominada a estrutura, auxilia na transferência espermática ao poro urogenital das fêmeas durante a cópula e se origina a partir do alongamento e fusão dos terceiro, quarto e quinto raios anteriores da nadadeira anal (Vidal et al., 2018; Wolff et al., 2007; Young et al., 2017). Quando nascidos, ambos sexos apresentam uma nadadeira idêntica (Tian et al., 2020), contudo, ao longo do seu desenvolvimento, as fêmeas crescem proporcionalmente a essa, enquanto os machos são sujeitos a uma série de modificações organogênicas andrógeno-dependentes que a diferenciam como corpo do gonopódio (Ogino, Katoh & Yamada, 2004). Sendo essencial à reprodução dos representantes da subfamília, o órgão é considerado um exímio biomarcador de exposição a desreguladores endócrinos, dada sua sensibilidade a presença de xenobióticos e seu caráter dimórfico e esteroide-dependente (Tian et al., 2020).
Sendo assim, é recorrente a análise de índices relacionados à morfologia reprodutiva dos Poeciliinae em ensaios de exposição. A avaliação desses só é possível devido a alterações decorrentes de disfunções endócrinas sobre o processo organogênico em questão (Angus et al., 2001). Young et al., (2020) relatam a inibição do desenvolvimento gonopodial de machos de C. decemmaculatus expostos ao 17α-etinilestradiol, enquanto Vidal et al., (2018) em seu estudo de áreas antropizadas relataram a formação de estruturas similares ao gonopódio em fêmeas da mesma espécie, efeito que fora associado pelos autores a possível presença de substâncias andrógenas.
Ao nível individual, além da análise de biomarcadores reprodutivos, é comum o emprego da aferência de índices e fatores de condição, além da quantificação de alterações histológicas em órgãos-alvo (Huang et al., 2024). Os parâmetros somáticos refletem repercussões negativas sobre o crescimento e desenvolvimento dos animais, sendo que a avaliação dos índices de condição hepatossomático e gonadossomático viabilizam a identificação e quantificação de acometimentos hepáticos e gonadais que os desreguladores possam desencadear, aumentando a ocorrência de desordens metabólicas, imunes, hormonais e gametogênicas (Li et al., 2025). Já os fatores de condição corpórea são empregados na determinação do status fisiológico dos animais, sendo o Fator de Condição de Fulton (K) baseado na premissa de que indivíduos de maior peso em determinado comprimento se encontram em melhores condições de saúde (Arias et al., 2007; Monaco, Suárez & Lima Junior, 2014).
No que tange a quantificação e alterações histopatológicas, cabe ressaltar que essas determinam de maneira semiquantitativa a presença de anormalidades em órgãos-alvo a partir da examinação de tecidos em microscopia (Yancheva et al., 2016). O estudo da histopatologia do fígado permite a identificação de danos passíveis de ocasionarem deficiências nutricionais e desordens metabólicas, afetando a fisiologia dos animais e sua capacidade de desintoxicação natural e armazenamento de energia, bem como suas funções imunes (Li et al., 2025; Ossana et al., 2019). Enquanto isso, o estudo histológico das gônadas qualifica anormalidades reprodutivas.
Ao fim e ao cabo, considerando que o conhecimento acerca de efeitos de substâncias androgênicas sobre a ictiofauna ainda é pouco entendido e buscado em pesquisas ecotoxicológicas (Huang et al., 2024), que os efeitos da exposição a um mesmo xenobiótico pode ser variável entre espécies e que organismos aquáticos são naturalmente expostos a concentrações subletais de forma contínua a contaminantes e poluentes (Bonifacio et al., 2016), justifica-se o presente estudo. O objetivo desse é a análise de biomarcadores somáticos, reprodutivos e histológicos em indivíduos de Cnesterodon decemmaculatus expostos a um desregulador endócrino (17α-metiltestosterona) durante 90 dias a partir do seu nascimento a concentrações ambientalmente relevantes do composto (10, 50 e 100 ng/L).
Metodologia
1 Coleta, aclimatação e obtenção dos alevinos
Fêmeas prenhes de Cnesterodon decemmaculatus (n=50) serão coletadas em um charco do Campus Capão do Leão da Universidade Federal de Pelotas e transferidas ao Laboratório de Fisiologia Aplicada à Aquicultura (LaFAAq), onde permanecerão isoladas até o nascimento da prole. Serão mantidas em berçários de 40 L, compartimentados com tela de 3 mm, para permitir o escape dos neonatos e impedir a predação. Os alevinos serão transferidos para unidades experimentais (UE) de 6 L, onde serão expostos a 17α-metiltestosterona. As fêmeas serão alimentadas com ração TetraMin® ad libitum 2x/dia, e os alevinos com microvermes da aveia (Panagrellus redivivus) e ração em pó (Alevinos®/Alcoon). A qualidade da água será monitorada diariamente sob condições controladas de temperatura (24 ºC), aeração constante, pH neutro e níveis reduzidos de resíduos nitrogenados (NH3, NO2- e NO3-) avaliados com emprego de kits analíticos colorimétricos (Alcoon®). O meio será renovado a cada 72h ou quando necessário.
2 Bioensaio de exposição
O experimento será conduzido em triplicata, com cerca de 20 indivíduos por réplica, os quais serão mantidos em unidades experimentais de 20 L por 90 dias. Os neonatos serão submetidos a três tratamentos de exposição crônica à 10, 50 e 100 ng/L de 17α-metiltestosterona, enquanto o grupo controle receberá o diluente do composto dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,002% durante um período de 90 dias contabilizado a partir do nascimento.
Os animais serão alimentados até a saciedade duas vezes ao dia com microvermes de aveia nos primeiros 20 dias de vida e posteriormente com ração comercial já mencionada anteriormente. Os parâmetros da água serão mantidos e avaliados conforme descrito no item anterior. O meio será renovado a cada 24h para manutenção da concentração de 17α-metiltestosterona.
3 Análise de biomarcadores somáticos
Os animais serão eutanasiados por imersão em benzocaína (250 ppm) até o cessar dos movimentos operculares, segundo as Diretrizes da Prática de Eutanásia do CONCEA. Em seguida, terão seu peso (g) e comprimento padrão (mm) aferidos com o auxílio de uma balança analítica (0,001 g) e um paquímetro digital (0,05 mm). Os dados serão registrados e identificados em uma planilha para análise estatística
3.1 Índice hepatossomático (IHS)
O fígado de 10 indivíduos (5 machos e 5 fêmeas) de cada réplica será removido e pesado em balança analítica (0,001 g) para o cálculo do IHS.
3.2 Índice gonadossomático (IGS)
As gônadas de 10 indivíduos (5 machos e 5 fêmeas) de cada réplica serão dissecadas e pesadas em balança analítica (0,001 g) para o cálculo do IGS.
3.3 Fator de Condição de Fulton (K)
O peso e o comprimento padrão de cada indivíduo serão usados na determinação do Fator de Condição de Fulton.
4 Análise de biomarcadores reprodutivos
Os índices reprodutivos adotados são baseados e descritos nos estudos de Vidal et al. (2018) e Young et al. (2017; 2020). Todas as aferições de medidas serão realizadas com paquímetro digital (0,05 mm).
4.1 Índice gonopodial (IG)
O comprimento do quarto raio da nadadeira anal dos machos será aferido e junto ao respectivo comprimento padrão será usado para determinação do IG.
4.2 Índice de masculinização de fêmeas (IMF)
O comprimento total da nadadeira anal de cada fêmea será aferido e junto ao respectivo comprimento padrão será usado para determinação do IMF.
4.3 Índice de alongamento do gonopódio (IAG)
O comprimento do quarto e do sexto raio da nadadeira anal de cada indivíduo serão usados para determinação do IAG.
5 Análises de biomarcadores histológicos
Os órgãos-alvo a serem analisados (fígado e gônadas) serão removidos dos animais (5 machos e 5 fêmeas por réplica) e, logo em seguida, fixados em solução de formaldeído a 4 % por 24h e conservados em etanol 70 %. No processamento, serão desidratados em série alcoólica, clarificados em xileno e emblocados em parafina. Após, serão seccionados em micrótomo (5 µm), cada secção será transferida a uma lâmina, a parafina será removida e os cortes serão corados com hematoxilina-eosina. As análises serão realizadas em microscópio óptico e as morfologias serão registradas por fotografia.
6 Análise de biomarcadores populacionais
6.1 Proporção macho:femêa
A sexagem dos animais será realizada por inspeção visual da nadadeira anal de cada indivíduo. Os animais serão classificados em quatro categorias, segundo os estudos de Vidal et al. (2018): (a) fêmeas fenotípicas (nadadeira anal sem raios fusionados ou alongados); (b) fêmeas masculinizadas (nadadeira anal alongada e/ou com fusão de raios) e (c) machos fenotípicos (gonopódio desenvolvido). Os machos terão seu gonopódio classificado em: primordial, alongado ou desenvolvido.
6.2 Mortalidade
A mortalidade será registrada diariamente via observação das unidades experimentais. Serão retirados e descartados quaisquer animais desfalecidos. O registro dos óbitos será computado para posterior análise das taxas de mortalidade.
7 Análise estatística
A comparação dos parâmetros médios será realizada por análise de variância de uma via (ANOVA), sob avaliação dos pressupostos paramétricos. Os percentuais entre sexo serão comparados por Qui-quadrado. Será empregado nível de significância de 95%.
Fêmeas prenhes de Cnesterodon decemmaculatus (n=50) serão coletadas em um charco do Campus Capão do Leão da Universidade Federal de Pelotas e transferidas ao Laboratório de Fisiologia Aplicada à Aquicultura (LaFAAq), onde permanecerão isoladas até o nascimento da prole. Serão mantidas em berçários de 40 L, compartimentados com tela de 3 mm, para permitir o escape dos neonatos e impedir a predação. Os alevinos serão transferidos para unidades experimentais (UE) de 6 L, onde serão expostos a 17α-metiltestosterona. As fêmeas serão alimentadas com ração TetraMin® ad libitum 2x/dia, e os alevinos com microvermes da aveia (Panagrellus redivivus) e ração em pó (Alevinos®/Alcoon). A qualidade da água será monitorada diariamente sob condições controladas de temperatura (24 ºC), aeração constante, pH neutro e níveis reduzidos de resíduos nitrogenados (NH3, NO2- e NO3-) avaliados com emprego de kits analíticos colorimétricos (Alcoon®). O meio será renovado a cada 72h ou quando necessário.
2 Bioensaio de exposição
O experimento será conduzido em triplicata, com cerca de 20 indivíduos por réplica, os quais serão mantidos em unidades experimentais de 20 L por 90 dias. Os neonatos serão submetidos a três tratamentos de exposição crônica à 10, 50 e 100 ng/L de 17α-metiltestosterona, enquanto o grupo controle receberá o diluente do composto dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,002% durante um período de 90 dias contabilizado a partir do nascimento.
Os animais serão alimentados até a saciedade duas vezes ao dia com microvermes de aveia nos primeiros 20 dias de vida e posteriormente com ração comercial já mencionada anteriormente. Os parâmetros da água serão mantidos e avaliados conforme descrito no item anterior. O meio será renovado a cada 24h para manutenção da concentração de 17α-metiltestosterona.
3 Análise de biomarcadores somáticos
Os animais serão eutanasiados por imersão em benzocaína (250 ppm) até o cessar dos movimentos operculares, segundo as Diretrizes da Prática de Eutanásia do CONCEA. Em seguida, terão seu peso (g) e comprimento padrão (mm) aferidos com o auxílio de uma balança analítica (0,001 g) e um paquímetro digital (0,05 mm). Os dados serão registrados e identificados em uma planilha para análise estatística
3.1 Índice hepatossomático (IHS)
O fígado de 10 indivíduos (5 machos e 5 fêmeas) de cada réplica será removido e pesado em balança analítica (0,001 g) para o cálculo do IHS.
3.2 Índice gonadossomático (IGS)
As gônadas de 10 indivíduos (5 machos e 5 fêmeas) de cada réplica serão dissecadas e pesadas em balança analítica (0,001 g) para o cálculo do IGS.
3.3 Fator de Condição de Fulton (K)
O peso e o comprimento padrão de cada indivíduo serão usados na determinação do Fator de Condição de Fulton.
4 Análise de biomarcadores reprodutivos
Os índices reprodutivos adotados são baseados e descritos nos estudos de Vidal et al. (2018) e Young et al. (2017; 2020). Todas as aferições de medidas serão realizadas com paquímetro digital (0,05 mm).
4.1 Índice gonopodial (IG)
O comprimento do quarto raio da nadadeira anal dos machos será aferido e junto ao respectivo comprimento padrão será usado para determinação do IG.
4.2 Índice de masculinização de fêmeas (IMF)
O comprimento total da nadadeira anal de cada fêmea será aferido e junto ao respectivo comprimento padrão será usado para determinação do IMF.
4.3 Índice de alongamento do gonopódio (IAG)
O comprimento do quarto e do sexto raio da nadadeira anal de cada indivíduo serão usados para determinação do IAG.
5 Análises de biomarcadores histológicos
Os órgãos-alvo a serem analisados (fígado e gônadas) serão removidos dos animais (5 machos e 5 fêmeas por réplica) e, logo em seguida, fixados em solução de formaldeído a 4 % por 24h e conservados em etanol 70 %. No processamento, serão desidratados em série alcoólica, clarificados em xileno e emblocados em parafina. Após, serão seccionados em micrótomo (5 µm), cada secção será transferida a uma lâmina, a parafina será removida e os cortes serão corados com hematoxilina-eosina. As análises serão realizadas em microscópio óptico e as morfologias serão registradas por fotografia.
6 Análise de biomarcadores populacionais
6.1 Proporção macho:femêa
A sexagem dos animais será realizada por inspeção visual da nadadeira anal de cada indivíduo. Os animais serão classificados em quatro categorias, segundo os estudos de Vidal et al. (2018): (a) fêmeas fenotípicas (nadadeira anal sem raios fusionados ou alongados); (b) fêmeas masculinizadas (nadadeira anal alongada e/ou com fusão de raios) e (c) machos fenotípicos (gonopódio desenvolvido). Os machos terão seu gonopódio classificado em: primordial, alongado ou desenvolvido.
6.2 Mortalidade
A mortalidade será registrada diariamente via observação das unidades experimentais. Serão retirados e descartados quaisquer animais desfalecidos. O registro dos óbitos será computado para posterior análise das taxas de mortalidade.
7 Análise estatística
A comparação dos parâmetros médios será realizada por análise de variância de uma via (ANOVA), sob avaliação dos pressupostos paramétricos. Os percentuais entre sexo serão comparados por Qui-quadrado. Será empregado nível de significância de 95%.
Indicadores, Metas e Resultados
As metas são a apresentação de ferramentas de acompanhamento de impacto ambiental por andrógenos antrópicos como desreguladores endócrinos em peixes. Os indicadores do estudo serão o número de biomarcadores identificados como eficientes no acompanhamento do impacto desses contaminantes como desreguladores endócrinos da espécie alvo elegida, reforçando seu papel como sentinela ambiental, bem como as publicações que apresentem esses resultados.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| CAROLINE DA SILVA ABRAAO | |||
| GILSON DE MENDONCA | 6 | ||
| MAIRA LOPES DA SILVA | |||
| RICARDO BERTEAUX ROBALDO | 7 | ||
| TAINÁ GUILLANTE |