Nome do Projeto
Influência de diferentes concentrações de glicose sobre a função vascular da insulina em artérias pulmonares de ratos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2025 - 30/11/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O sistema vascular desempenha um papel essencial na manutenção das funções corporais, sendo que desequilíbrios na regulação do tônus de seus componentes provocam implicações significativas para a saúde em geral. O endotélio desempenha um papel fundamental nesta questão, visto que fisiologicamente funciona como um órgão dinâmico que age equilibrando a produção de vasodilatadores, como o óxido nítrico, e vasoconstritores, como a endotelina-1. Uma doença que está relacionada com o desequilíbrio nesta regulação é a diabetes mellitus (DM), caracterizada pela hiperglicemia, com elevados índices de mortalidade e morbidade em decorrência de complicações cardiovasculares. Apesar da hiperglicemia crônica afetar a função vascular por diversos mecanismos, nem todo dano vascular se justifica apenas pelo controle glicêmico insuficiente. Além disso, devido a diferenças na patogênese entre ambos os tipos de DM, a tendência é que as complicações vasculares se desenvolvam de maneiras distintas entre estes pacientes. A principal diferença entre DM1 e DM2 está nos níveis de insulina, que também possui um papel relevante na homeostase vascular, onde seu excesso provoca vasoconstrição exacerbada e disfunção vascular. O leito vascular pulmonar é um dos únicos no qual os efeitos do DM não foram bem estudados. Atualmente, os estudos clínicos e pré-clínicos se concentram em compreender os mecanismos patológicos e complicações de cada tipo de DM isoladamente. Porém a investigação integrada, explorando diferenças na evolução do dano entre os tipos de DM, com enfoque na artéria pulmonar, pode embasar intervenções personalizadas de diagnóstico e tratamento precoces nestes pacientes. Com isso, o objetivo do projeto é analisar a influência de diferentes concentrações de glicose sobre a ação vasomotora da insulina em artérias pulmonares de ratos.
Objetivo Geral
Avaliar como diferentes concentrações de glicose influenciam a ação da insulina sobre artérias pulmonares.
Justificativa
De acordo com dados da Federação Internacional de Diabetes, em 2021 o número de diabéticos no mundo era aproximadamente 536,6 milhões, podendo chegar a 783,2 milhões até 2045 (SUN et al., 2022). Uma análise conjunta publicada recentemente englobou cerca de 1108 estudos, mostrando essa tendência de aumento em casos de DM entre os anos de 1980 a 2022 em 200 países. Os autores concluíram que houve um aumento de mais de 630 milhões de diabéticos no período analisado, chegando a uma estimativa de 828 milhões no ano de 2022. Destacando-se que este aumento ocorreu principalmente em países de baixa / média renda (NCD Risk Factor Collaboration, 2024).
O DM aumenta significativamente o risco de doenças vasculares, que são uma das principais causas de mortalidade entre esses pacientes. Contudo, as complicações vasculares diferem entre indivíduos com DM1 e DM2, devido a presença ou não da hiperinsulinemia combinada com a hiperglicemia (ADEVA-ANDANY et al., 2019, DOMINGUETI et al., 2016, WEI et al., 2022). O leito vascular pulmonar é um dos únicos no qual os efeitos do DM não foram bem estudados. O sistema de classificação atual para HP não incorpora DM. Contudo, estão surgindo evidências que sugerem não apenas que o DM está associado à HP, mas também pode alterar fundamentalmente o prognóstico nestes pacientes, podendo aumentar o risco de morte em 31% (GRINNAN et al., 2016, TRAMMELL et al., 2020).
Além disso, atualmente os estudos clínicos e pré-clínicos se concentram em compreender os mecanismos patológicos e complicações de cada tipo de DM isoladamente (WEI et al., 2022). Porém a investigação integrada, explorando diferenças na evolução do dano entre os tipos de DM, com enfoque no leito vascular pulmonar, pode embasar intervenções personalizadas de diagnóstico e tratamento precoces nestes pacientes, melhorando os resultados e reduzindo a carga de hipertensão pulmonar na população diabética.
Com isso, o objetivo do projeto é realizar um estudo pré-clínico, com artérias pulmonares isoladas, tratando-a com diferentes concentrações de glicose e insulina, em conjunto e separadas, para analisar a repercussão destas intervenções na função vascular e como os níveis de glicose direcionam os efeitos da insulina neste contexto.
O DM aumenta significativamente o risco de doenças vasculares, que são uma das principais causas de mortalidade entre esses pacientes. Contudo, as complicações vasculares diferem entre indivíduos com DM1 e DM2, devido a presença ou não da hiperinsulinemia combinada com a hiperglicemia (ADEVA-ANDANY et al., 2019, DOMINGUETI et al., 2016, WEI et al., 2022). O leito vascular pulmonar é um dos únicos no qual os efeitos do DM não foram bem estudados. O sistema de classificação atual para HP não incorpora DM. Contudo, estão surgindo evidências que sugerem não apenas que o DM está associado à HP, mas também pode alterar fundamentalmente o prognóstico nestes pacientes, podendo aumentar o risco de morte em 31% (GRINNAN et al., 2016, TRAMMELL et al., 2020).
Além disso, atualmente os estudos clínicos e pré-clínicos se concentram em compreender os mecanismos patológicos e complicações de cada tipo de DM isoladamente (WEI et al., 2022). Porém a investigação integrada, explorando diferenças na evolução do dano entre os tipos de DM, com enfoque no leito vascular pulmonar, pode embasar intervenções personalizadas de diagnóstico e tratamento precoces nestes pacientes, melhorando os resultados e reduzindo a carga de hipertensão pulmonar na população diabética.
Com isso, o objetivo do projeto é realizar um estudo pré-clínico, com artérias pulmonares isoladas, tratando-a com diferentes concentrações de glicose e insulina, em conjunto e separadas, para analisar a repercussão destas intervenções na função vascular e como os níveis de glicose direcionam os efeitos da insulina neste contexto.
Metodologia
Metodologia
Local de realização
A pesquisa será desenvolvida nas dependências do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, e no Biotério central da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), ambos situados no Campus Capão do Leão da UFPel.
Considerações éticas
O projeto será submetido à Comissão de Ética de Uso em Animais (CEUA/UFPel) e os experimentos só terão início após sua aprovação. Todos os procedimentos deste estudo estão de acordo com a Lei 11.794, de 08 de outubro de 2008, que estabelece normas para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de animais; dos Princípios Éticos na Experimentação Animal, formulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal; assim como aquelas contidas nos Princípios Internacionais Orientadores para a pesquisa Biomédica envolvendo Animais provenientes do Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) (GOLDIM, 1997).
Animais
Serão utilizados ratos Wistar machos e fêmeas com 60 dias, tendo em vista a diferença no metabolismo de cada gênero, provenientes do Biotério do Campus Capão do Leão da UFPel. Esses serão mantidos em gaiolas de polipropileno (49x31x21cm) com assoalho coberto por maravalha, tampa em arame galvanizado, com bebedouro de polipropileno (700 mL de água) e ração padrão do biotério ad libitum. Durante todo período experimental, os animais permanecerão em sala com temperatura e umidade controladas (22-24°C e 40-60%, respectivamente) e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Os animais só sairão desse ambiente para realização da eutanásia e demais procedimentos post mortem.
Cálculo de tamanho amostral
O cálculo do tamanho amostral foi efetuado através da plataforma do site http://calculoamostral.bauru.usp.br/calculoamostral/ta_diferenca_media_ind ependente.php disponível para livre acesso. O n calculado para o primeiro experimento foi de 10 animais por grupo, utilizando dados do relaxamento máximo induzido pela acetilcolina do trabalho de Saemann et al., 2023. Já para o segundo experimento, o n calculado foi de 10 animais por grupo, utilizando dados da expressão proteica da proteína quinase B do trabalho de Amor et al., 2018. Foram considerados: probabilidade de erro α = 0,05, poder do teste estatístico (1 – β) = 0,90, sendo o n total de 80 animais (40 animais para experimento 1 e 40 animais para experimento 2).
Protocolo experimental
Nosso grupo de pesquisa possui experiência no protocolo de reatividade vascular e recentemente adquirimos equipamento para sua realização com vasos de ratos (Figura 8). Ou seja, não é possível utilizarmos vasos de animais de grande porte que por ventura nos fossem cedidos. Ademais, nosso equipamento tem apenas duas cubas até o momento, o que nos permite realizar os testes com no máximo dois vasos ao mesmo tempo. Logo, propomos eutanasiar dois animais por turno e usar suas artérias pulmonares (aneis com aproximadamente três milímetros) conforme realizado previamente (REIS et al, 2019).
Desenho experimental
Experimento 1: Incubação dos aneis de artéria pulmonar e posterior protocolo de reatividade vascular
Amostra do experimento 1: Só é possível extrair um anel de artéria pulmonar de cada animal e de acordo com cálculo amostral necessitaremos de 10 aneis de artérias pulmonares por grupo. Como neste experimento teremos 4 grupos, necessitaremos de 40 animais.
Objetivo do experimento 1: Avaliar a influência de diferentes concentrações de glicose e insulina sobre a função de artérias pulmonares isoladas.
Para isso, os animais serão submetidos à eutanásia por anestésico inalatório (isoflurano - dose ao efeito) seguido de decapitação. Feito isso, a artéria pulmonar de cada animal será excisada (aproximadamente 3 mm de comprimento) e imersa em uma placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit para retirada cuidadosa do tecido conjuntivo e adiposo. Os aneis então serão incubados em placas de cultura de 6 poços com 1,5 ml de Dulbecco's Modified Eagle's Medium e Ham's F12 medium (DMEM/F-12) com glutamina de Gibco (mistura 1:1), suplementado com 100U/ml penicilina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Serão acrescidas na incubação glicose e/ou insulina conforme os grupos experimentais (Tabela 1) e assim permanecerão em incubadora de 95% de O2 e 5% de CO2 a 37 °C pelo período de 24 horas. Para cada grupo serão utilizados 10 aneis de artérias pulmonares. Visto que a glicose é um componente necessário para manutenção da integridade do vaso, não teremos nenhum vaso com ausência de glicose. O nosso controle será o G1, visto que está exposto a quantidade basal de glicose de 5,5mM.
Concentrações de glicose de acordo com LIN et al., 2017 e de insulina de acordo com AMOR et al., 2018.
Após a incubação, os vasos serão preparados para realização da reatividade vascular utilizando o Sistema de Aquisição de Dados PowerLab (PL3508/P, ADInstruments) (MULVANY E HALPERN,1977). Para isso, serão mantidos em meio Krebs-Henseleit (37°C, pH 7,4) e fixados com fios de aço inoxidável à alavanca de um transdutor de deslocamento de força (TIM-100, AVS).
Após estabilização em tensão fixa de 1,5 g por aproximadamente 30 minutos, será adicionado cloreto de potássio (KCl, 80 mM) a solução de Krebs-Henseleit para avaliarmos a integridade funcional do vaso e para obtermos a tensão máxima. Em seguida, a solução será trocada três vezes para retirada do KCl e os vasos serão novamente estabilizados. Então, os vasos serão pré contraídos com fenilefrina (10-6 M) e, em ato contínuo, submetidos a uma curva de acetilcolina (Ach 10-10 até 10-5 M) para análise da resposta vasodilatadora dependente do endotélio (PEÇANHA et al., 2008). O meio então será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados. Após estabilização, os vasos serão pré contraídos com fenilefrina (10-6 M) e, em ato contínuo, submetidos a uma curva de insulina (Ins 10-10 até 10-5 M) (GUERRA-OJEDA et al., 2023).
Como os vasos serão submetidos a todos estes elementos citados anteriormente, não seria possível utilizá-los para o experimento 2, o que justifica a necessidade de mais animais para sua realização.
Experimento 2: Incubação dos aneis de artéria pulmonar e posterior análise de biologia molecular
Amostra experimento 2: Visto que não podemos reaproveitar as amostras do experimento anterior, serão necessários mais animais para esta análise. De acordo com o cálculo amostral necessitaremos de um n de 10 animais por grupo, como são 4 grupos, precisaremos de um n total de 40 animais.
Objetivo experimento 2: Avaliar a participação da PI3K, Akt, eNOS, GLUT4, ETA na influência de diferentes concentrações de glicose e insulina sobre a função de artérias pulmonares isoladas.
Após incubação, os vasos serão homogeneizados e preparados para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se os anticorpos específicos contra PI3K, Akt, eNOS, GLUT4, ETA. Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil). As membranas serão, então, reveladas pelo uso de reagentes para detecção por quimioluminescência no iBrightTM CL 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e serão analisadas com o programa ImageJ (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, EUA).
Descarte de materiais biológicos e químicos
As carcaças dos animais eutanasiados serão dispensadas em saco plástico fechado e depositados em bombonas, com tampa para recolhimento, no Biotério Central da UFPEL, por empresa especializada. Materiais perfurocortantes que tenham contato com líquidos corpóreos dos animais, como agulhas e seringas, serão descartados em caixa de papelão amarela conforme protocolo do Ministério de Saúde. Materiais tóxicos e contaminados serão tratados conforme protocolo da instituição.
Análises estatísticas
Para determinação da normalidade será utilizado o teste de Shapiro-Wilk. Se os dados apresentarem distribuição normal de variância homogênea, será utilizada análise de variância (ANOVA) sequencial seguida do pós-teste de Bonferroni para detectar diferença significativa entre os grupos (quando P<0,05). Caso o conjunto dos dados não apresente distribuição normal, os mesmos serão analisados por testes estatísticos não paramétricos. As análises serão realizadas usando o software GraphPad Prism 8.0.
Local de realização
A pesquisa será desenvolvida nas dependências do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, e no Biotério central da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), ambos situados no Campus Capão do Leão da UFPel.
Considerações éticas
O projeto será submetido à Comissão de Ética de Uso em Animais (CEUA/UFPel) e os experimentos só terão início após sua aprovação. Todos os procedimentos deste estudo estão de acordo com a Lei 11.794, de 08 de outubro de 2008, que estabelece normas para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de animais; dos Princípios Éticos na Experimentação Animal, formulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal; assim como aquelas contidas nos Princípios Internacionais Orientadores para a pesquisa Biomédica envolvendo Animais provenientes do Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) (GOLDIM, 1997).
Animais
Serão utilizados ratos Wistar machos e fêmeas com 60 dias, tendo em vista a diferença no metabolismo de cada gênero, provenientes do Biotério do Campus Capão do Leão da UFPel. Esses serão mantidos em gaiolas de polipropileno (49x31x21cm) com assoalho coberto por maravalha, tampa em arame galvanizado, com bebedouro de polipropileno (700 mL de água) e ração padrão do biotério ad libitum. Durante todo período experimental, os animais permanecerão em sala com temperatura e umidade controladas (22-24°C e 40-60%, respectivamente) e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Os animais só sairão desse ambiente para realização da eutanásia e demais procedimentos post mortem.
Cálculo de tamanho amostral
O cálculo do tamanho amostral foi efetuado através da plataforma do site http://calculoamostral.bauru.usp.br/calculoamostral/ta_diferenca_media_ind ependente.php disponível para livre acesso. O n calculado para o primeiro experimento foi de 10 animais por grupo, utilizando dados do relaxamento máximo induzido pela acetilcolina do trabalho de Saemann et al., 2023. Já para o segundo experimento, o n calculado foi de 10 animais por grupo, utilizando dados da expressão proteica da proteína quinase B do trabalho de Amor et al., 2018. Foram considerados: probabilidade de erro α = 0,05, poder do teste estatístico (1 – β) = 0,90, sendo o n total de 80 animais (40 animais para experimento 1 e 40 animais para experimento 2).
Protocolo experimental
Nosso grupo de pesquisa possui experiência no protocolo de reatividade vascular e recentemente adquirimos equipamento para sua realização com vasos de ratos (Figura 8). Ou seja, não é possível utilizarmos vasos de animais de grande porte que por ventura nos fossem cedidos. Ademais, nosso equipamento tem apenas duas cubas até o momento, o que nos permite realizar os testes com no máximo dois vasos ao mesmo tempo. Logo, propomos eutanasiar dois animais por turno e usar suas artérias pulmonares (aneis com aproximadamente três milímetros) conforme realizado previamente (REIS et al, 2019).
Desenho experimental
Experimento 1: Incubação dos aneis de artéria pulmonar e posterior protocolo de reatividade vascular
Amostra do experimento 1: Só é possível extrair um anel de artéria pulmonar de cada animal e de acordo com cálculo amostral necessitaremos de 10 aneis de artérias pulmonares por grupo. Como neste experimento teremos 4 grupos, necessitaremos de 40 animais.
Objetivo do experimento 1: Avaliar a influência de diferentes concentrações de glicose e insulina sobre a função de artérias pulmonares isoladas.
Para isso, os animais serão submetidos à eutanásia por anestésico inalatório (isoflurano - dose ao efeito) seguido de decapitação. Feito isso, a artéria pulmonar de cada animal será excisada (aproximadamente 3 mm de comprimento) e imersa em uma placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit para retirada cuidadosa do tecido conjuntivo e adiposo. Os aneis então serão incubados em placas de cultura de 6 poços com 1,5 ml de Dulbecco's Modified Eagle's Medium e Ham's F12 medium (DMEM/F-12) com glutamina de Gibco (mistura 1:1), suplementado com 100U/ml penicilina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Serão acrescidas na incubação glicose e/ou insulina conforme os grupos experimentais (Tabela 1) e assim permanecerão em incubadora de 95% de O2 e 5% de CO2 a 37 °C pelo período de 24 horas. Para cada grupo serão utilizados 10 aneis de artérias pulmonares. Visto que a glicose é um componente necessário para manutenção da integridade do vaso, não teremos nenhum vaso com ausência de glicose. O nosso controle será o G1, visto que está exposto a quantidade basal de glicose de 5,5mM.
Concentrações de glicose de acordo com LIN et al., 2017 e de insulina de acordo com AMOR et al., 2018.
Após a incubação, os vasos serão preparados para realização da reatividade vascular utilizando o Sistema de Aquisição de Dados PowerLab (PL3508/P, ADInstruments) (MULVANY E HALPERN,1977). Para isso, serão mantidos em meio Krebs-Henseleit (37°C, pH 7,4) e fixados com fios de aço inoxidável à alavanca de um transdutor de deslocamento de força (TIM-100, AVS).
Após estabilização em tensão fixa de 1,5 g por aproximadamente 30 minutos, será adicionado cloreto de potássio (KCl, 80 mM) a solução de Krebs-Henseleit para avaliarmos a integridade funcional do vaso e para obtermos a tensão máxima. Em seguida, a solução será trocada três vezes para retirada do KCl e os vasos serão novamente estabilizados. Então, os vasos serão pré contraídos com fenilefrina (10-6 M) e, em ato contínuo, submetidos a uma curva de acetilcolina (Ach 10-10 até 10-5 M) para análise da resposta vasodilatadora dependente do endotélio (PEÇANHA et al., 2008). O meio então será renovado três vezes e os vasos novamente estabilizados. Após estabilização, os vasos serão pré contraídos com fenilefrina (10-6 M) e, em ato contínuo, submetidos a uma curva de insulina (Ins 10-10 até 10-5 M) (GUERRA-OJEDA et al., 2023).
Como os vasos serão submetidos a todos estes elementos citados anteriormente, não seria possível utilizá-los para o experimento 2, o que justifica a necessidade de mais animais para sua realização.
Experimento 2: Incubação dos aneis de artéria pulmonar e posterior análise de biologia molecular
Amostra experimento 2: Visto que não podemos reaproveitar as amostras do experimento anterior, serão necessários mais animais para esta análise. De acordo com o cálculo amostral necessitaremos de um n de 10 animais por grupo, como são 4 grupos, precisaremos de um n total de 40 animais.
Objetivo experimento 2: Avaliar a participação da PI3K, Akt, eNOS, GLUT4, ETA na influência de diferentes concentrações de glicose e insulina sobre a função de artérias pulmonares isoladas.
Após incubação, os vasos serão homogeneizados e preparados para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se os anticorpos específicos contra PI3K, Akt, eNOS, GLUT4, ETA. Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil). As membranas serão, então, reveladas pelo uso de reagentes para detecção por quimioluminescência no iBrightTM CL 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e serão analisadas com o programa ImageJ (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, EUA).
Descarte de materiais biológicos e químicos
As carcaças dos animais eutanasiados serão dispensadas em saco plástico fechado e depositados em bombonas, com tampa para recolhimento, no Biotério Central da UFPEL, por empresa especializada. Materiais perfurocortantes que tenham contato com líquidos corpóreos dos animais, como agulhas e seringas, serão descartados em caixa de papelão amarela conforme protocolo do Ministério de Saúde. Materiais tóxicos e contaminados serão tratados conforme protocolo da instituição.
Análises estatísticas
Para determinação da normalidade será utilizado o teste de Shapiro-Wilk. Se os dados apresentarem distribuição normal de variância homogênea, será utilizada análise de variância (ANOVA) sequencial seguida do pós-teste de Bonferroni para detectar diferença significativa entre os grupos (quando P<0,05). Caso o conjunto dos dados não apresente distribuição normal, os mesmos serão analisados por testes estatísticos não paramétricos. As análises serão realizadas usando o software GraphPad Prism 8.0.
Indicadores, Metas e Resultados
Com a realização deste projeto esperamos determinar a influência da hiperglicemia sobre os efeitos vasculares da insulina. Neste sentido, esperamos observar um dano vascular tanto em situações de hiperglicemia, como também de hiperinsulinemia, efeitos potencializados quando somados. Ou seja, o projeto contribuirá para o entendimento mecanístico das complicações no leito vascular pulmonar causadas pela hiperglicemia e pela hiperinsulinemia, isoladamente e em conjunto, simulando o que acontece em pacientes com DM1 e DM2. Considerando que a classificação da HP e manejo da HAP não mencionam um papel potencial dos distúrbios no metabolismo da glicose e que existem diferenças entre o dano vascular de pacientes DM1 e DM2, este projeto contribuirá com dados que podem embasar evidências futuras que apoiem mudanças na classificação e também no manejo personalizado destes pacientes.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| BRUNA DO NASCIMENTO BASSI | |||
| PAULO CAVALHEIRO SCHENKEL | 1 |