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As frutas vermelhas estão em destaque devido à grande aceitação pelo seu sabor, aparência e aroma, mas também pela presença dominante de compostos fenólicos, os quais estão diretamente associados a diversas atividades funcionais e, principalmente à prevenção de doenças crônicas (AABY et al., 2012).
O morango (Fragaria x ananassa Duch.) pertencente à família Rosaceae, está entre as frutas vermelhas mais consumidas no mundo por apresentar aroma e gosto agradáveis e textura suculenta, além disso é considerado uma boa fonte de folato e potássio, e uma ótima fonte de fibra alimentar, vitamina C, manganês e substâncias antioxidantes como fitoquímicos (GARCIA et al., 1998; CEREZO et al., 2010).
A fruta é não climatérica, entretanto, apresenta alta perecibilidade, podendo apenas ser estocada por pequenos períodos (BRON, 2007). Assim, técnicas de preservação eficazes são necessárias para prolongar a vida útil do morango, a fim de manter suas propriedades físicas e nutricionais. O congelamento é uma das técnicas de preservação de alimentos mais comuns e bem estabelecidas, que diminui a taxa de deterioração, reduzindo a mobilidade molecular, as atividades microbianas, enzimáticas, oxidativas e a taxa respiratória (BILBAO-SAINZ et al., 2019).
Ainda que o congelamento seja considerado uma das maneiras mais fáceis de preservar a qualidade dos alimentos, a preservação do morango por congelamento traz consequências danosas, pois se verifica o branqueamento do fruto, em função da perda de antocianinas, oxidação dos compostos fenólicos pela polifenoloxidase, oxidação da vitamina C, além da perda de exsudados e de textura, devido ao dano provocado pelos cristais de gelo (BERBARI et al., 1998; RENO et al., 2011; ABD-ELHADY, 2014; BULUT et al., 2018).
Assim, diferentes pré-tratamentos têm sido avaliados com o intuito de manter as características do morango submetido ao congelamento, como imersão em sacarose, cloreto de cálcio, pectina associada a aplicação de calor (BERBARI et al., 1998); sacarose e cloreto de cálcio (SUUTARINEN et al., 2000); revestimento de quitosana adicionado de lactato de cálcio/gluconato de cálcio e vitamina E (HAN et al., 2004); infusão a vácuo de cloreto de cálcio e da enzima pectinametilesterase (BUGGENHOUT et al., 2006); pré-tratamento à base de ácido ascórbico, sacarose e pectina de baixo teor de metoxilação (OSZMIANSKI et al., 2009); imersão de morangos em soluções de pectimetilesterase previamente ao congelamento por imersão em solução de cloreto de cálcio (GALETTO et al., 2010); impregnação a vácuo de cloreto de cálcio, pectina e glicose (RENO et al., 2011); imersão em ácido cítrico e lactato de cálcio associado ao resfriamento a 5 ºC overnight (ABD-ELHADY, 2014) e tratamento com suco de limão, ácido ascórbico, sacarose, cloreto de cálcio, alginato e pectina de baixo teor de metoxilação (YU; LIAO, 2016).
De modo geral, os trabalhos utilizam um agente de firmeza (cloreto de cálcio, lactato de cálcio ou gluconato de cálcio) e um agente antioxidante (ácido cítrico ou ácido ascórbico), sendo principalmente utilizados como revestimento carboidratos, como sacarose, glicose e pectina; poucos são os trabalhos que avaliaram a utilização de outros polissacarídeos, como quitosana e alginato. Os revestimentos influenciam, principalmente, na redução da perda por exsudação e de reações de oxidação (HAN et al., 2004; BERBARI et al., 2008; OSZMIANSKI et al., 2009).
A gelatina é uma proteína de origem animal obtida do colágeno por hidrólise ácida ou básica, e amplamente utilizada na indústria alimentícia (FAKHOURI et al., 2007). Como revestimento, tem apresentado bons resultados na conservação de vegetais in natura e minimamente processados (LICODIEDOFF et al., 2016; MANNUCCI et al., 2017; RADI et al., 2017; AITBOULAHSEN et al., 2018). Entretanto, trabalhos com a utilização de gelatina em vegetais submetidos ao congelamento não foram encontrados.
Alimentos funcionais são aqueles que contêm ingredientes que trazem benefícios específicos para a saúde (ANNUNZIATA; VECCHIO, 2013). Como é o caso dos alimentos adicionados de probióticos. Microrganismos probióticos têm sido adicionados em vegetais minimamente processados (RÖßLE et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014; RUSSO et al., 2014; SHIGEMATSU et al., 2018; SPERANZA et al., 2018), porém em vegetais congelados, não foram encontrados relatos na literatura. A Saccharomyces boulardii é um microrganismo probiótico que atua na regulação das bactérias microbianas intestinais, interferindo na capacidade dos patógenos de colonizar e infectar a mucosa, na modulação das respostas imunológicas, na estabilização da barreira gastrointestinal, na inibição de enzimas pró-carcinogênicas e na indução da atividade enzimática, que promove a absorção de nutrientes (VANDENPLAS, 2009).

Serão utilizados morangos (Fragaria x ananassa Duch.), cultivar Camarosa adquiridos de um produtor do distrito de Cerrito Alegre na cidade de Pelotas/RS (latitude: -31.776, longitude: -52.3594, 31° 46′ 34″ Sul, 52° 21′ 34″ Oeste).
Os morangos serão selecionados quanto à ausência de defeitos fisiológicos, tamanho e cor (>75% da superfície de coloração vermelha). Após serão lavados com água e sanitizados em solução de hipoclorito de sódio 200 mg L-1, pH entre 6,5 e 7,0, por 15 minutos.
Os seguintes tratamentos serão avaliados: Tratamento A: Controle 1 (morango armazenado a -18ºC); Tratamento B: controle 2 (morango armazenado a -80 ºC); Tratamento C: morangos adicionados de ácido cítrico (1,0% p/v), cloreto de cálcio (1,0% p/v), glicerol (1,0% p/v) e Saccharomyces boulardii CNCM I-745 (2,2 x 108 UFC.mL-1) armazenados a -18ºC; Tratamento D: morangos adicionados de gelatina (5,0% p/v), ácido cítrico (1,0% p/v), cloreto de cálcio (1,0% p/v), glicerol (1,0% p/v) e Saccharomyces boulardii CNCM I-745 (2,2 x 108 UFC.mL-1) armazenados a -18ºC.
No tratamento A os morangos serão armazenados em freezer a -18 ºC (Consul, Brasil), já no tratamento B, os morangos serão armazenados em ultra freezer a -80 ºC (Coldlab, Brasil).
Nos tratamentos C e D será utilizado um cultivo liofilizado da levedura Saccharomyces boulardii CNCM I-745 (Merck, França), contendo 2,2 x 108 UFC.mL-1. Além deste, serão adicionados ácido cítrico (1,0% p/v), cloreto de cálcio (1,0% p/v) e glicerol (1,0% p/v), sob agitação por 10 minutos à temperatura ambiente.
No tratamento D também será empregada gelatina (Royal, Brasil), a qual será preparada por dissolução em água destilada na concentração de 5% (p/v). A solução será homogeneizada em agitador magnético à 60 ºC por 30 min. Após a dissolução serão adicionados o microrganismo liofilizado, o cloreto de cálcio, o ácido cítrico e o glicerol, sob agitação por 10 minutos à temperatura ambiente.
Para os tratamentos C e D, os frutos serão totalmente submersos nas soluções por 30 seg e secos sob ventilação forçada à temperatura ambiente (15 ºC).
Os morangos serão embalados em sacos de polietileno de alta densidade, padronizando o número de frutos por embalagem (200 g) e armazenados a -18 ºC ou -80 ºC conforme tratamento, durante 90 dias.
O delineamento experimental utilizado será inteiramente ao acaso, em esquema fatorial 4 x 4, sendo 4 tratamentos (A, B, C e D) e 4 períodos de avaliação (0, 30, 60 e 90 dias de armazenamento), sendo as avaliações realizadas no mínimo em triplicata.
Avaliações
Perda de líquido por exsudação
A perda de líquido por exsudação será determinada através da diferença de peso antes e após o descongelamento dos morangos (HAN et al., 2004). O descongelamento será realizado sob refrigeração a 4 ºC overnight. A perda de líquido será calculada como percentagem de perda de peso inicial.

pH
O pH será determinado em uma suspensão preparada com 10 g de morango, triturado e homogeneizado com 100 mL de água destilada, com o auxílio de potenciômetro (Analyser) (IAL, 2008).

Acidez total titulável
A acidez total titulável será determinada por titulação potenciométrica de 10 g de amostra triturada e homogeneizada com 100 mL de água destilada. A amostra será titulada utilizando-se solução de NaOH 0,1 mol.L-1 até uma faixa de pH (8,2-8,4). Os resultados serão expressos em porcentagem (IAL, 2008).

Vitamina C
Vinte gramas de morangos triturados serão misturados com 50 mL de água, 10 mL de solução de ácido sulfúrico a 20% (v/v), 1 mL da solução de iodeto de potássio a 10% (v/v) e 1 mL da solução de amido a 1% (p/v), sendo a titulação realizada com solução de iodato de potássio 0,002 mol.L-1 até coloração rosada. Os resultados serão expressos em mg.100 g-1 de amostra (IAL, 2008).

Sólidos solúveis
Os sólidos solúveis serão determinados em refratômetro de bancada do tipo Abbé, a 20 ºC (IAL, 2008).

Firmeza
As medidas de firmeza dos morangos serão determinadas utilizando-se o texturometro (Stable Micro Systems TA.XTplus).

Cor
A cor será determinada utilizando-se um colorímetro Minolta CR 400. No padrão C.I.E L*a*b*, onde a coordenada L* expressa o grau de luminosidade da cor medida (L* = 100 = branco; L* = 0 = preto), a coordenada a* expressa o grau de variação entre o vermelho (+60) e o verde (-60) e a coordenada b* expressa o grau de variação entre o azul (-60) e o amarelo (+60).

Compostos fenólicos totais
Para o preparo do extrato hidroalcoólico, os morangos serão triturados e 5 g destes serão adicionados de 50 mL de solução metanólica (70% metanol/30% de água). O extrato ficará 3 h sob agitação a temperatura ambiente, após será submetido à filtração em papel qualitativo.
A determinação dos compostos fenólicos totais seguirá a metodologia proposta por Singleton et al. (1999) com algumas modificações. Alíquotas de 1 mL do extrato hidroalcoólico (70% metanol/30% água) serão adicionadas de 1 mL de solução Folin-Ciocalteau e, posteriormente, 8 mL de água destilada. Após 3 min de reação, 1 mL de Na2CO3 1 mol.L-1 será adicionado e a mistura incubada a 37 ºC por 30 min. A absorbância da solução resultante será medida em espectrofotômetro (AAKER) a 750 nm. A quantificação será realizada utilizando a curva de calibração realizada com o ácido gálico nas concentrações de 0 a 0,5 mg.mL-1. Os resultados serão expressos em mg EAG.100g-1 de morangos.

Antocianinas
Para o preparo do extrato hidroalcoólico, os morangos serão triturados e 5 g destes serão adicionados de 50 mL de solução metanólica (70% metanol/30% de água). O extrato ficará 3 h sob agitação a temperatura ambiente, após será submetido à filtração em papel qualitativo.
O conteúdo de antocianinas será determinado pelo método do pH diferencial (LEE et al., 2005). Para isso, 1 mL do extrato será adicionado de 4 mL de tampão cloreto de potássio pH 1,0 (0,025 mol.L-1) e em outra porção de amostra adicionado de 4 mL de tampão de acetato de sódio pH 4,5 (0,4 mol.L-1). Após 20 min com a amostra no escuro será realizada leitura em espectrofotômetro (AAKER), nos comprimentos de onda de 520 nm e 700 nm. Os resultados serão calculados conforme as equações 2 e 3 e os resultados expressos em mg eq. pelargonidina-3-glicosídeo por 100 g (base úmida).
Atividade antioxidante
Para o preparo do extrato hidroalcoólico, os morangos serão triturados e 5 g destes serão adicionados de 50 mL de solução metanólica (70% metanol/30% de água). O extrato ficará 3 h sob agitação a temperatura ambiente, após será submetido à filtração em papel qualitativo.
A determinação da atividade antioxidante será realizada seguindo o método DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) de acordo com Brand-Willians et al. (1995). Serão utilizados 750 μL do extrato hidroalcoólico (70% metanol/30% água) em 3750 μL de DPPH (0,5 mM), a leitura realizada após 20 min, em espectrofotômetro (AAKER), a 515 nm. Os resultados serão expressos em porcentagem de inibição.


Atividade enzimática
Para a extração das enzimas, 1 g do tecido congelado será homogeneizado com 10 mL de tampão fosfato 0,05 mol.L-1, pH 7, contendo 1% de polivinilpirrolidona e imediatamente filtrado. O homogenato obtido será centrifugado por 15 min a 7.000 g e temperatu¬ra de 3 °C (MATSUNO; URITANI, 1972). O sobrenadante resultante será utilizado para a determinação da atividade enzimática da enzima polifenoloxidase.
Na determinação da atividade da enzima polifenoloxidase, 1 mL de extrato enzimáti¬co será adicionado a 3,6 mL de tampão fosfato 0,05 mol.L-1, pH 6 e 0,1 mL de catecol 0,1 mol.L-1. A solução obtida será incubada durante 30 min a 30 °C, e imediatamente resfriado em banho de gelo e realizada a leitura em espectrofotômetro (AAKER) no comprimento de onda de 395 nm. A atividade enzimática da polifenoloxidase será expressa em unidade (atividade enzimática capaz de alterar 0,001 de absorbância a 395 nm) por grama de polpa fresca por minuto (UAE.g-1.min-1) (CAMPOS; SILVEIRA, 2003).

Contagem de Saccharomyces boulardii
A contagem das leveduras será realizada de acordo com os procedimentos propostos por Downes e Ito (2001). Para todas as amostras serão realizadas diluições seriadas em solução salina estéril (0,85%) até a diluição 10-9 para a quantificação das leveduras na solução de revestimento e até 10-7 para a contagem nos morangos, as análises serão realizadas em duplicata.
Para a contagem de fungos (bolores e leveduras), será utilizado o método de plaqueamento em Ágar Batata Dextrose, sendo as placas incubadas a 25 ºC. Serão realizadas contagens aos três e aos cinco dias de incubação. O resultado será expresso em UFC.g-1.

Análise estatística
Os resultados obtidos serão submetidos à análise de variância e a comparação de médias entre os tratamentos será realizada pelo Teste de Tukey com nível de significância de 5%, utilizando-se o programa STATISTIX 10. Para a avaliação do tempo de armazenamento será calculado o intervalo de confiança a 95%.

Meta

Obter morangos enriquecidos com microrganismo probiótico revestidos com gelatina que preservem suas características na conservação por congelamento.

Resultados esperados
Como resultado, espera-se obter morangos congelados em que sejam mantidas as características físicas e químicas, assim como a viabilidade da levedura Saccharomyces boulardii, afim de que se obtenha um alimento funcional.
No decorrer deste projeto haverá a participação de alunos da graduação e mestrado, assim, o mesmo deverá contribuir para a formação de recursos humanos.
Ao final de 12 meses, conforme cronograma do projeto, os resultados serão publicados em encontro científico da área de alimentos e ao final do projeto os resultados serão submetidos à publicação em periódico.