Nome do Projeto
Otimização do bioprocesso de obtenção de Poli-3hidroxibutirato [P(3HB)] sintetizado por bactéria da espécie Ralstonia solanacearum através do uso de métodos fermentativos e análises moleculares
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/06/2020 - 31/05/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
Devido à baixa biodegradabilidade ambiental dos plásticos de origem petroquímica, estes têm se tornado um dos principais poluentes ambientais, se acumulando no ambiente e impactando principalmente a fauna marinha. Como uma alternativa, vem sendo estudada a produção de bioplásticos, como o Poli-3hidroxibutirato (P(3HB)), o qual possui algumas características físico químicas semelhantes ao Polipropileno (PP), principal plástico petroquímico utilizado industrialmente, sendo assim, um possível substituto a este. No entanto, a produção do P(3HB) ainda possui um custo elevado em comparação com os plásticos petroquímicos. Dessa forma, o objetivo deste projeto é otimizar a produção do P(3HB) produzido pela bactéria brasileira Ralstonia solanacearum RS, através de técnicas fermentativas e moleculares, testando diferentes formas de fermentação como sólida, alimentada e submersa, assim como comparar meios de cultura com diferentes relações de carbono/nitrogênio, tanto em biorreator como em agitador orbital (shaker). Ainda, pretende-se utilizar técnicas de biologia molecular como eletroforese, Reação em cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em tempo real, para conseguir compreender pela primeira vez nesta espécie, qual rota metabólica é utilizada na síntese do P(3HB) e quais enzimas podem ser utilizadas futuramente para possíveis melhoramentos genéticos. Para isso, pretendemos também realizar, pela primeira vez, o sequenciamento completo do genoma desta cepa. Assim, espera-se futuramente que os dados obtidos a partir deste projeto possam permitir o escalonamento industrial do P(3HB) a nível nacional.

Objetivo Geral

Objetiva-se neste trabalho otimizar o bioprocesso de produção do P(3HB), através do aprimoramento de seus parâmetros fermentativos, utilizando dois meios de cultivo, YM (Yeast Malt) e Nutrient Broth (NB), com diferentes relações de C/N; Verificar sua interação e compreender a expressão gênica das enzimas relacionadas à síntese do P(3HB), pela primeira vez, na espécie Ralstonia solanacearum; E realizar a sua transformação genética, a partir da seleção de alvos enzimáticos, elevando a sua produção e visando seu escalonamento industrial.

Justificativa

Devido à baixa biodegradabilidade ambiental dos plásticos de origem petroquímica, estes têm se tornado um dos principais poluentes ambientais, se acumulando no ambiente e impactando principalmente a fauna marinha. A fim de encontrar alternativas ecologicamente sustentáveis, diversas pesquisas ao redor do mundo veem estudando a produção de bioplásticos, materiais produzidos através de fontes renováveis e/ou que possuem uma maior biodegradabilidade no ambiente. Aliado a isto, faz-se necessário que este possua um baixo custo de produção, tornando-o competitivo economicamente, e propriedades físico-químicas que permitam sua utilização em diversas áreas industriais, assim como os plásticos convencionais.
Dentre estes bioplásticos estudados, a classe dos Polihirdoxialcanoatos (PHA’s) é uma das principais estudadas, sendo caracterizados por serem biopolímeros produzidos naturalmente por microrganismos, como reserva de carbono e energia. Dentre esta classe um dos principais biopolímeros estudados é o Poli-3hidroxibutirato (P(3HB)), o qual possui algumas características físico químicas semelhantes ao Polipropileno (PP), que é o principal plástico petroquímico utilizado industrialmente, sendo assim, um possível substituto a este.
No entanto, a produção do P(3HB) ainda possui um custo elevado em comparação com os plásticos petroquímicos. Os principais pontos que encarecem sua produção são a fonte de carbono, responsável por 25 a 45% do custo de produção, e o processo de extração que pode chegar a até 50%. Dessa forma, diversos pesquisadores têm tentado otimizar a produção deste bioplástico, aumentando sua produção e diminuindo seus custos, e dessa forma aumentando sua competitividade e estimulando seu escalonamento a nível industrial. Apesar de diversos países já produzirem-no a nível industrial, o Brasil não possui nenhuma empresa atualmente.
Dessa forma, o objetivo deste projeto é otimizar a produção do P(3HB) produzido pela bactéria brasileira Ralstonia solanacearum RS, através de técnicas fermentativas e moleculares, testando diferentes formas de fermentação, como sólida, alimentada e submersa, assim como comparar meios de cultura com diferentes concentrações de carbono/nitrogênio. Ainda, pretende-se utilizar técnicas de biologia molecular para conseguir compreender pela primeira vez nesta espécie, qual rota metabólica é utilizada na síntese do P(3HB) e quais enzimas podem ser utilizadas futuramente para possíveis melhoramentos genéticos. Para isso, pretendemos também realizar, pela primeira vez, o sequenciamento completo do genoma desta cepa. Assim, espera-se futuramente que os dados obtidos a partir deste projeto possam permitir o escalonamento industrial do P(3HB) a nível nacional.

Metodologia

Serão utilizadas metodologias clássicas descritas na literatura para o acompanhamento do processo produtivo do bioplástico sintetizado pela bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS, a qual, faz parte da coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Tecnologia de Bioprocessos da Universidade Federal de Pelotas. Será acompanhada a curva de crescimento celular por densidade óptica (DO) e citometria de fluxo (CF), a quantificação de P(3HB), o pH, a massa celular seca (MCS) e a microscopia de fluorescência.
A expressão gênica das enzimas relacionadas a sua rota de biossíntese será realizada partindo-se do desenho dos primers, a extração do RNA microbiano, a análise por PCR convencional para avaliar a eficiência dos primers desenhados, a análise da expressão gênica utilizando a técnica de PCR Real Time (RT-PCR).
Amplificação das amostras de DNA
As amostras anteriormente extraídas serão quantificadas e terão sua qualidade avaliada através da leitura de sua absorbância a 260 nm em aparelho NanoVue™ Plus Spectrophotometer e armazenada à -20 ºC ou 4 ºC dependendo do seu uso. Após, serão amplificadas a partir da técnica de PCR convencional em termociclador (T100TM da Bio-Rad). Utilizando 6,25 μL de gotaq mix contendo DNTP’s, tampão e cloreto de magnésio; 3,75 μL de água miliq autoclavada; 1,25 μL do primer forward e 1,25 μL do primer reverse e 1,0 μL do DNA. São usadas as seguintes condições: 94 ºC por 4 minutos; 94 ºC por 40 segundos; 55 ºC por 40 segundos; 72 ºC por 2 minutos; repetir o passo 2 35x; 72 ºC por 7 minutos; 10 ºC por 10 minutos e 4 ºC por 90 segundos. Posteriormente, é realizada através da técnica de eletroforese em gel de agarose, utilizando tampão TBE (Tampão Tris-Ácido Bórico-EDTA) 0,5%, 0,8% de agarose, 2 μL de corante 6x Loading Dye e 6 μL de brometo.
Os parâmetros relacionados a transformação genética serão a seleção do vetor de expressão e clonagem e a fermentação da bactéria modificada geneticamente.

Indicadores, Metas e Resultados

- Seleção do melhor meio de inóculo.
- Análise da expressão gênica das enzimas da rota de produção do P(3HB).
- Seleção de alvos enzimáticos
- Aumento do rendimento de P(3HB).
- Escalonamento industrial.

A partir deste trabalho espera-se compreender melhor o metabolismo e síntese de P(3HB) pela bactéria Ralstonia solanacearum RS além de otimizar sua produção a fim de alcançar níveis industrialmente competitivos, visando seu futuro escalonamento. Objetiva-se também realizar a publicação de artigos científicos e a submissão de trabalhos acadêmicos em eventos científicos da área pelos alunos de iniciação científica vinculados ao projeto.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAMILA RIOS PIECHA
CAROLINE DE PAULA LOPES CORREA3
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE3
MARIA LUIZA DE OLIVEIRA ZANINI
PATRÍCIA SILVA DIAZ 4
TAISHA CARVALHO ALVES
VANESSA GALLI3

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