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Devido à baixa biodegradabilidade ambiental dos plásticos de origem petroquímica, estes têm se tornado um dos principais poluentes ambientais, se acumulando no ambiente e impactando principalmente a fauna marinha. A fim de encontrar alternativas ecologicamente sustentáveis, diversas pesquisas ao redor do mundo veem estudando a produção de bioplásticos, materiais produzidos através de fontes renováveis e/ou que possuem uma maior biodegradabilidade no ambiente. Aliado a isto, faz-se necessário que este possua um baixo custo de produção, tornando-o competitivo economicamente, e propriedades físico-químicas que permitam sua utilização em diversas áreas industriais, assim como os plásticos convencionais.
Dentre estes bioplásticos estudados, a classe dos Polihirdoxialcanoatos (PHA’s) é uma das principais estudadas, sendo caracterizados por serem biopolímeros produzidos naturalmente por microrganismos, como reserva de carbono e energia. Dentre esta classe um dos principais biopolímeros estudados é o Poli-3hidroxibutirato (P(3HB)), o qual possui algumas características físico químicas semelhantes ao Polipropileno (PP), que é o principal plástico petroquímico utilizado industrialmente, sendo assim, um possível substituto a este.
No entanto, a produção do P(3HB) ainda possui um custo elevado em comparação com os plásticos petroquímicos. Os principais pontos que encarecem sua produção são a fonte de carbono, responsável por 25 a 45% do custo de produção, e o processo de extração que pode chegar a até 50%. Dessa forma, diversos pesquisadores têm tentado otimizar a produção deste bioplástico, aumentando sua produção e diminuindo seus custos, e dessa forma aumentando sua competitividade e estimulando seu escalonamento a nível industrial. Apesar de diversos países já produzirem-no a nível industrial, o Brasil não possui nenhuma empresa atualmente.
Dessa forma, o objetivo deste projeto é otimizar a produção do P(3HB) produzido pela bactéria brasileira Ralstonia solanacearum RS, através de técnicas fermentativas e moleculares, testando diferentes formas de fermentação, como sólida, alimentada e submersa, assim como comparar meios de cultura com diferentes concentrações de carbono/nitrogênio. Ainda, pretende-se utilizar técnicas de biologia molecular para conseguir compreender pela primeira vez nesta espécie, qual rota metabólica é utilizada na síntese do P(3HB) e quais enzimas podem ser utilizadas futuramente para possíveis melhoramentos genéticos. Para isso, pretendemos também realizar, pela primeira vez, o sequenciamento completo do genoma desta cepa. Assim, espera-se futuramente que os dados obtidos a partir deste projeto possam permitir o escalonamento industrial do P(3HB) a nível nacional.

Serão utilizadas metodologias clássicas descritas na literatura para o acompanhamento do processo produtivo do bioplástico sintetizado pela bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS, a qual, faz parte da coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Tecnologia de Bioprocessos da Universidade Federal de Pelotas. Será acompanhada a curva de crescimento celular por densidade óptica (DO) e citometria de fluxo (CF), a quantificação de P(3HB), o pH, a massa celular seca (MCS) e a microscopia de fluorescência.
A expressão gênica das enzimas relacionadas a sua rota de biossíntese será realizada partindo-se do desenho dos primers, a extração do RNA microbiano, a análise por PCR convencional para avaliar a eficiência dos primers desenhados, a análise da expressão gênica utilizando a técnica de PCR Real Time (RT-PCR).
Amplificação das amostras de DNA
As amostras anteriormente extraídas serão quantificadas e terão sua qualidade avaliada através da leitura de sua absorbância a 260 nm em aparelho NanoVue™ Plus Spectrophotometer e armazenada à -20 ºC ou 4 ºC dependendo do seu uso. Após, serão amplificadas a partir da técnica de PCR convencional em termociclador (T100TM da Bio-Rad). Utilizando 6,25 μL de gotaq mix contendo DNTP’s, tampão e cloreto de magnésio; 3,75 μL de água miliq autoclavada; 1,25 μL do primer forward e 1,25 μL do primer reverse e 1,0 μL do DNA. São usadas as seguintes condições: 94 ºC por 4 minutos; 94 ºC por 40 segundos; 55 ºC por 40 segundos; 72 ºC por 2 minutos; repetir o passo 2 35x; 72 ºC por 7 minutos; 10 ºC por 10 minutos e 4 ºC por 90 segundos. Posteriormente, é realizada através da técnica de eletroforese em gel de agarose, utilizando tampão TBE (Tampão Tris-Ácido Bórico-EDTA) 0,5%, 0,8% de agarose, 2 μL de corante 6x Loading Dye e 6 μL de brometo.
Os parâmetros relacionados a transformação genética serão a seleção do vetor de expressão e clonagem e a fermentação da bactéria modificada geneticamente.

- Seleção do melhor meio de inóculo.
- Análise da expressão gênica das enzimas da rota de produção do P(3HB).
- Seleção de alvos enzimáticos
- Aumento do rendimento de P(3HB).
- Escalonamento industrial.

A partir deste trabalho espera-se compreender melhor o metabolismo e síntese de P(3HB) pela bactéria Ralstonia solanacearum RS além de otimizar sua produção a fim de alcançar níveis industrialmente competitivos, visando seu futuro escalonamento. Objetiva-se também realizar a publicação de artigos científicos e a submissão de trabalhos acadêmicos em eventos científicos da área pelos alunos de iniciação científica vinculados ao projeto.