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De acordo com as prioridades definidas no âmbito do Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações (MCTIC), no que se refere a projetos de pesquisa, de desenvolvimento de tecnologias e inovações, o presente projeto possui aderência ao setor de biotecnologia da área de Tecnologia Habilitadora, ao setor de agronegócio da área de Tecnologia de Produção e ao setor de saúde da área de Tecnologia para Qualidade de Vida definidas pelo MCTIC, atendendo as solicitações da Portaria MCTIC nº 1.122, de 19.03.2020 que visam: I- contribuir para a alavancagem em setores com maiores potencialidades para a aceleração do desenvolvimento econômico e social do país; II - promover o alinhamento institucional de todos órgãos que integram a estrutura organizacional do MCTIC, com intuito de obter sinergia entre eles para melhorar a alocação de recursos orçamentários e financeiros, humanos, de logística e de infraestrutura e III - racionalizar o uso dos recursos orçamentários e financeiros, conforme a programação inicial do PPA 2020-2023.

Análises in vitro das matérias primas
As matérias primas terão suas características farmacotécnicas avaliadas in
vitro através da verificação macroscópica de sua consistência e seus aspectos
morfológicos. O pH de cada adjuvante será determinado, mensurando-o na
substância pura (se for líquido) ou em solução aquosa a 5% (se for sólido) com
auxílio de um potenciômetro digital (Analion®). Os insumos pré-selecionados serão
testados quanto a sua compatibilidade com a substância ativa, a fim de verificar a
formação de precipitados ou de agregados, não desejáveis quando se busca uma
formulação homogênea. Será feita uma mistura de Butafosfan e adjuvante, na
proporção de 1:1, 1:2 e 1:5, das matérias-primas em análise. As substâncias
sólidas serão dissolvidas na quantidade suficiente do solvente apropriado e as
líquidas serão testadas na sua forma pura. Após a análise visual do comportamento
da formulação, as matérias-primas que não resultarem numa mistura límpida e
homogênea, serão descartadas (Ferreira, 1999).

Ensaios in vitro com a formulação preparada
Nessa etapa, a formulação previamente pronta será submetida a ensaios
laboratoriais para verificação de seus efeitos. Será preparada uma simulação in
vitro, da liberação sustentada de Butafosfan, a partir da qual serão feitos os ajustes
julgados necessários, tanto na concentração do princípio ativo, como na quantidade
dos adjuvantes.

Preparo da formulação
Serão preparadas quatro formulações contendo as dose 2500, 5000, 7500 e
10000 mg de Butafosfan, incorporadas aos adjuvantes necessários, de modo a
preparar 4 protótipos com diferentes concentrações do ativo e um sem a presença
do Butafosfan, para servir como grupo controle (Gennaro, 2004). As doses serão
baseadas na posologia da forma injetável recomendada para ovinos. Porém,
levando-se em conta que trata-se de outra via de administração e, portanto, uma
biodisponibilidade diferente, será feita a avaliação deste parâmetro a fim de verificar
o percentual realmente absorvido do total de ativo administrado. Será considerada
a volemia de um ovino de aproximadamente 50 kg de peso vivo, visando atingir a
quantidade necessária para o mesmo ter o aporte energético desejável.

Simulação in vitro da liberação de Butafosfan
As quatro formulações preparadas serão acondicionadas separadamente em
compartimentos que simularão o ambiente vaginal. Este simulador corresponderá a
um banho-maria a 37 °C, contendo 4 recipientes fechados, cada um com solução
de ácido láctico de pH 5,0 visando simular a temperatura, umidade e pH vaginaisA
cada 2 h será determinada a quantidade de massa perdida pelos dispositivos,
pesando-os. Nesse mesmo momento será retirada uma amostra de solução de
cada compartimento, para se mensurar a concentração do ativo através da análise
em HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (Farmacopéia Brasileira IV,
1998). Estas análises serão repetidas durante o tempo necessário para que todo o
dispositivo se desfaça no meio em que está inserido. Esse estudo servirá para
ajustar previamente a quantidade do ativo liberado, e também para determinarmos
a quantidade necessária dos adjuvantes para garantir a durabilidade intravaginal do
dispositivo durante o intervalo de tempo desejado.

Análise in vivo da formulação preparada
Após o ajuste do tempo de desintegração e dissolução da formulação a
partir dos testes in vitro, serão feitos os testes em animais, de modo a se averiguar
se a liberação satisfatória observada nos testes in vitro se reproduz também in vivo.
Nesta fase será avaliado não apenas a inocuidade dos adjuvantes com respeito
aos efeitos farmacológicos (Vila Jato, 1997; Ansel et al., 2000), mas também serão
feitos os ajustes das doses necessárias para desempenharem o efeito terapêutico.
Porém, levando-se em consideração que se trata de outra via de
administração e, portanto, uma biodisponibilidade diferente, será realizada essa
avaliação, traçando uma curva a partir da dosagem sérica, por HPLC da
concentração de Butafosfan durante 24 h após a administração dos dispositivos.
Assim, saberemos o percentual realmente absorvido do total de ativo administrado.
Apesar de terem sido feitas adequações de doses nos testes in vitro, as
mesmas poderão ser ajustadas nos ensaios in vivo, pois nem tudo que se observa
in vitro, se reproduz nos animais. Nesta análise, o objetivo é estabelecer a relação
entre a tolerância das substâncias, efeitos farmacodinâmicos e a dose. Serão
testadas diferentes doses do ativo, comportadas em 4 formulações, para verificar
as diferentes respostas, a fim de obter um protótipo aceitável (Lullimann, 1993).

Experimento in vivo
Serão utilizados 25 ovinos da raça Texel, com cerca de dois anos de idade,
que serão adquiridos pelo Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária
(NUPEEC), para uso exclusivo neste projeto. Os animais serão mantidos no
pavilhão de ovinos, junto ao Hospital de Clínicas Veterinária da UFPel, ficando sob
responsabilidade do NUPEEC. A dieta a ser ofertada atenderá todas as exigências
nutricionais do NRC (National Research Council) e as condições sanitárias para
manutenção dos animais seguirão as premissas de ética e bem estar animal.
Serão utilizadas ovelhas pois, além da cetose acometer também ovinos, a
espécie apresenta pequeno porte e, consequente menor necessidade de espaço,
quando comparada a bovinos (Cezar et al., 2004), podendo ser utilizados como
modelos experimentais, favorecendo a realização de estudos que permitam a
geração de conhecimentos aplicáveis a outras espécies (Mikel et al., 2004).
Serão utilizados 25 animais, divididos em grupos de (5) ovelhas mantidas
sob mesma condição de manejo, sendo induzidas a cetose. Para a indução, os
animais serão submetidos a uma dieta hipercalórica, contendo 120% dos
requerimentos exigidos pelo NRC (2001), durante 15 dias, e em seguidas serão
submetidos a uma restrição alimentar, contendo 80% das exigências nutricionais do
NRC (2001). A restrição será feita até que surjam sinais clínicos de cetose
(Radostits et al., 2000). Os animais terão monitorados seus níveis séricos de
glicose e pela presença de corpos cetônicos na urina (Fleming, 1993). Somente
serão utilizadas nos tratamentos, as ovelhas que demonstrarem sinais clínicos de
cetose. Os grupos serão tratados conforme descrito a seguir:
- T1: 5 ovelhas tratadas com a formulação 1 (2,5 g de Butafosfan+adjuvantes);
- T2: 5 ovelhas tratadas com a formulação 2 (5 g de Butafosfan+adjuvantes);
- T3: 5 ovelhas tratadas com a formulação 3 (7,5 g de Butafosfan+adjuvantes).
- T4: 5 ovelhas tratadas com a formulação 4 (10 g de Butafosfan+ adjuvantes).
- T5: 5 ovelhas usadas como grupo controle (dispositivo placebo).
A implantação dos dispositivos será realizada de maneira asséptica de
modo a evitar qualquer tipo de contaminação que comprometa o experimento.
Durante as primeiras 24 h, serão coletadas amostras de sangue, para
verificar a concentração sérica de Butafosfan de modo a traçar uma curva de
biodisponibilidade a partir da administração intravaginal. Esta dosagem será feira
por HPLC. Serão ainda, avaliados a cada 12 h, os níveis séricos de glicose, NEFA
(Ácidos graxos não esterificados); BHBA (β-hidroxi-butirato); cálcio; fósforo, GGT
(Gama glutamil transferase) e AST (Aspartato amino transferase) (Labtest
Diagnóstica S.A., Brasil). As amostras serão coletadas em frasco contendo
anticoagulante (EDTA 10%) e antiglicolítico (Fluoreto de Potássio 12%),
centrifugadas a 3500 rpm e armazenadas a -20 ºC até serem analisadas.
Todos os animais do experimento serão acompanhados durante todo o
período experimental, através de realização de exame clínicos verificando a
resposta ao tratamento e, portanto, a evolução do quadro clínico (Pugh, 2004).

Ensaios de inocuidade e citotoxicidade
Servirão para avaliar a inocuidade e o potencial citotóxico dos componentes
da formulação. O método de análise será baseado nas metodologias de cultivo de
fibroblastos em placas, para avaliar a viabilidade celular por meio da exclusão de
células coradas com corante específico. Primeiramente, será avaliada a resposta
celular imediata ao contato com as soluções (curto prazo). Após 72 horas, com as
culturas de células já confluentes, o meio de cultura será substituído por meio
contendo as soluções da substância a ser testada, diluídas a 0,1 e 0,5%. Como
controle, serão utilizadas placas com meio de cultura sem solução irrigante. Após 0,
6, 12 e 24 horas de contato com as substâncias, as culturas serão tripsinizadas e
sua células contadas em câmara de Neubauer. Na segunda fase do estudo, será
avaliado o crescimento e a proliferação celular, em que os fibroblastos serão
plaqueados numa densidade de 1 x 10 células por placa de Petri (longo prazo) com
as soluções a serem testadas nas diluições de 0,1 e 0,55. Como controle será
utilizada apenas cultura fresca.

Metas:
i. Desenvolvimento de um sistema intravaginal polimérico de liberação
sustentada para tratamento de cetose em ruminantes,
ii. Validação in vivo e in vitro do sistema desenvolvido.