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A diarreia neonatal é uma das principais causas de mortalidade em bezerros e também de perdas econômicas na pecuária, principalmente por retardo de crescimento e número de óbitos, o qual pode chegar a 20% (Mota et al., 2000). Estima-se que a doença gere um custo global equivalente a US$ 33,46 bezerro/ano (Botteon et al., 2008). Esta é considerada uma doença multifacetada e multifatorial, podendo envolver o animal, o ambiente, a nutrição e agentes infecciosos (Buzinaro et al., 2003; Fontes et al., 2006). Em relação aos agentes causadores, destacam-se: bactérias (Escherichia coli, Salmonella sp.), vírus (rotavírus e coronavírus) e protozoários (Eimeria sp.) (Embrapa, 2017).
Quando acometidos de diarreia, os bezerros apresentam alterações digestivas que levam à menor absorção de nutrientes (Benesi, 1999), acarretando em falhas no tratamento destes animais e, inclusive levando a óbito. Os óbitos comumente estão relacionados ao comprometimento de múltiplos sistemas do organismo, sendo a etiologia primária a enfermidade digestiva, potencializada pelos desequilíbrios hidroeletrolítico, acidobásico, endotoxemia e choque (Foster & Smith, 2009).
Ainda, a ocorrência de diarreia resulta em processo inflamatório/infeccioso, os quais estão diretamente relacionados com déficit no crescimento. Em modelos humanos e ratos, bem como in vitro, foi demonstrado o efeito negativo de citocinas produzidas durante a resposta de fase aguda sobre o metabolismo. Por exemplo, TNF-α pode inibir a produção de IGF-I e tem sido relacionada com a ocorrência de proteólise, resistência à insulina e anorexia, podendo assim diminuir o crescimento e o desempenho de bovinos (Gifford et al., 2012).
Devido ao fato de que a maior ocorrência de diarreias ocorre pela ação de bactérias patogênicas no intestino, como medida profilática os antimicrobianos são comumente adicionados à alimentação animal (Braidwood e Henry, 1990), assim como são considerados como fármacos de eleição em tratamentos (Silva et al., 2019). No entanto o uso indiscriminado de antibióticos na produção animal pode contribuir para a resistência de bactérias a estes antibióticos (Fey et al., 2000), e por isto alternativas ao uso deste produto estão sendo estimulados.
O uso de ácidos graxos de cadeias curtas na nutrição de ruminantes é amplamente conhecido. Um exemplo disso é a utilização do butirato em bezerras jovens, com o objetivo de desenvolvimento ruminal (Heinrichs, 2005; Lesmeister & Heinrichs, 2005; Khan et al., 2016). Recentemente o butirato vem sendo cogitado como uma potencial ferramenta no controle de diarreias neonatais, visto que possui ação benéfica ao trato gastrointestinal. (Górka, et al., 2018). Em monogástricos, o butirato parece prevenir a colonização do trato gastrointestinal por agentes potencialmente patogênicos (Galfi e Bokori, 1990; Fernández-Rubio et al., 2009), mas se este resultado é um efeito direto ou indireto do uso do butirato, ainda precisa ser esclarecido (Moquet et al., 2016). Em bezerros, o uso do butirato também reduziu desordens digestivas nos animais (Górka et al., 2011). Assim, o uso de butirato de forma contínua pode ser uma alternativa eficaz no controle e prevenção de diarreias neonatais em bezerras, potencializando seu desenvolvimento corporal e diminuindo os custos com tratamento da doença.

Recursos Humanos
Este projeto está vinculado às linhas de pesquisa referente à Clínica Metabólica, nas quais já viemos desenvolvendo atividades dentro do grupo de pesquisa NUPEEC - Estudos em Metabolismo Animal. Para o desenvolvimento deste projeto, serão envolvidos nas atividades de pesquisa relacionadas orientados dos Programas de Pós-Graduação em Biotecnologia, Medicina Veterinária e Zootecnia, bem como estudantes de iniciação científica dos cursos de graduação em Medicina Veterinária, Agronomia e Zootecnia, sendo um importante instrumento de formação de recursos humanos.

Local e animais
O experimento será realizado em uma fazenda comercial de sistema intensivo de produção de leite, denominada de Granjas 4 irmãos, situada no município de Rio Grande - RS. Nesta propriedade, os bezerros nascem em piquete maternidade e são alojados em bezerreiro ripado e elevado, alimentados com 6 litros de leite por dia, ração e água a vontade. São desaleitados aos noventa dias de idade.
Serão utilizados 112 animais da raça Holandesa, sendo 100 bezerras e 12 bezerros. Estes serão distribuídos aleatoriamente após o nascimento em dois grupos distintos (conforme segue abaixo). Logo após o nascimento, será realizada a identificação com brincos apropriados, e os animais serão transferidos e alojados em baias com escamoteador e cama de maravalha. A colostragem será realizada nas primeiras 12 horas pós-nascimento através da mamada observada ou fornecimento de colostro fresco. A cura do umbigo com iodo a 10% será realizada a cada 12 horas nos primeiros 3 dias. Após isto, os animais serão então transferidos para o bezerreiro e alimentados diariamente com seis litros de leite, além de água e ração ad libitum.

Grupos experimentais
Os 112 animais serão identificados com brincos numerados segundo protocolo da fazenda e divididas aleatoriamente, por ordem de nascimento, em dois grupos. O Grupo tratamento (50 fêmeas e 6 machos, n=56) receberá diariamente, durante todo o período de aleitamento, um produto comercial contendo butirato, adicionado ao leite, de acordo com recomendação do fabricante (4g/dia, 0,2% da MS total). O Grupo controle (50 fêmeas e 6 machos, n=56) será constituído por animais que receberão apenas o leite, sem nenhum aditivo.

Avaliação da transferência de imunidade passiva
Entre 24 a 48 horas de vida, será realizada coleta de sangue dos animais utilizando sistema vaccutainer em tubo com anticoagulante EDTA. O plasma será separado para mensuração da transferência de imunidade passiva através método de proteína sérica total, em refratômetro.

Avaliações metabólicas
As avaliações metabólicas consistirão em coletas entre as primeiras 24 a 48 horas de vida dos animais, seguido de analises a cada 7 dias durante os 30 dias de vida, sendo que, as avaliações metabólicas ocorrerão em 20 animais de cada grupo. As coletas serão realizadas pela manhã, antes do fornecimento do leite aos animais.
Serão utilizados tubos sem anticoagulante com sistema vaccutainer, acessando a veia jugular para coleta de sangue, e após centrifugação e separação do plasma para determinação dos níveis de cálcio total, PPT (proteína plasmática total), albumina, fósforo, cloreto, magnésio, BHBA (beta hidroxibutirato), NEFA (ácidos graxos não esterificados) uréia e paraoxonase. Em amostras de sangue contendo fluoreto de potássio será mensurado o lactato e glicose. As amostras coletadas serão avaliadas em analisador bioquímico automático Labmax Plenno (Labtest Diagnóstica SA, MG, Brasil).

Escore de fezes e diagnóstico de diarreia
A consistência das fezes será determinada diariamente até os 30 dias de idade, utilizando-se o seguinte escore: 0 (fezes normais), 1 (fezes pastosas), 2 (fezes aquosas), 3 (diarreia profusa com fezes liquefeitas) e 4 (diarreia profusa com fezes liquefeitas e sanguinolenta). A partir do escore de fezes, determinaremos que aqueles animais que apresentarem valores iguais ou acima de 2 ( 2 a 4) serão caracterizados como animais que apresentam fezes diarreicas e que, portanto, o dia que o animal começar a excretar fezes com estas características será definido como o dia de início da diarreia, e o dia que este mesmo animal voltar a defecar fezes de escore 0 ou 1, caracterizar-se-á o dia de término da diarreia.
A partir do início do quadro de diarreia serão realizados exames clínicos a cada dois dias, sendo determinada a temperatura retal, frequência cardíaca, frequência respiratória e grau de hidratação. O tratamento para diarreia será de acordo com o estipulado pelo Médico Veterinário da propriedade.

Coleta de amostras para avaliação do microbioma fecal e característica ruminal
Amostras de fezes serão coletadas diretamente da ampola retal de 40 bezerras de cada grupo, nos dia 0, 7, 14, 21, 28 e no dia 1 do diagnóstico de diarreia. As amostras serão colidas, colocas em criotubos identificados e posteriormente armazenadas em nitrogênio líquido, para posteriores avaliações de microbioma fecal por expressão genica de proteínas relacionadas a bactérias de interesse.
Nos dias 7, 14 e 21, pós nascimento, os bezerros machos terão seu liquido ruminal coletado com auxilio de sonda ruminal, com o objetivo de avaliar o pH e a microbiota ruminal (avaliação de potencial redox, motilidade de protozoários e contagem de protozoários).

Ocorrência de doenças
Os animais serão diariamente monitorados quanto à ocorrência de diarreia. A partir deste acompanhamento, serão determinados índices de morbidade (número de animais que adoeceram dividido pelo número total de animais), casos fatais (número de animais que vieram a óbito dividido pelo número de animais que adoeceram), mortalidade (número de animais que vieram a óbito dividido pelo número total de animais), recidivas (número de animais que adoeceram mais de duas vezes dividido pelo número de animais que adoeceram pelo menos uma vez). Será também determinada a ocorrência de outras doenças neonatais, gerando incidência de cada doença e a mortalidade geral (número total de animais que morreram dividido pelo número total de animais).
Quando diagnosticados com diarreia os animais serão monitorados quanto ao tempo de tratamento para a enfermidade.

Avaliações zootécnicas
Os animais serão avaliados ao nascer e semanalmente até os primeiro 30 dias de vida, e após, aos 45 dias, 60 dias e finalmente avaliados ao desmame (90 dias). Será avaliado o peso corporal utilizando balança e fita de pesagem para animais de grande porte. A partir deste resultado, será determinado o ganho de peso médio diário. Também, serão feitas medidas de altura da cernelha e largura na garupa e perímetro torácico com o auxílio de régua graduada em centímetros.

Avaliações histológicas e expressão gênica
Aos 30 dias de vida seis machos de cada grupo sofrerão eutanásia para avaliação do desenvolvimento dos estômagos e intestino. A realização da eutanásia seguirá as recomendações dadas pelo Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV) expressas na Resolução nº 1000, de 11 de Maio de 2012.
Após confirmação do óbito, o rúmen e o abomaso dos animais serão dissecados, e o fluido ruminal será coletado para avaliação de ácidos graxos voláteis (Erwin et al., 1961), N-NH3 (Conway, 1962), determinação do pH do trato gastrointestinal e avaliação da microbiota ruminal.
O rúmen-retículo, omaso e abomaso serão separados, esvaziados, lavados repetidamente com água, secos e posteriormente pesados individualmente.
Um centímetro quadrado de diferentes tecidos será coletado e fixados em formol a 4%, cinco dias antes de ser armazenado em etanol e posterior incorporação na parafina para avaliações como comprimento e largura das papilas, e espessura da musculatura ruminal de acordo com Gorká (2011). O trato gastrointestinal também será coletado visando análises imunohistoquímicas para avaliar fatores de crescimento e apoptose, os fragmentos serão armazenados em formol a 10% para promover a fixação do tecido. Também serão coletadas amostras de tecido do intestino, visando avaliar expressão gênica de IGF-1 (fator de crescimento semelhante a insulina) e outros genes relacionados ao desenvolvimento tecidual e apoptose. As amostras de tecido serão congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC. A extração do RNA das células será feita usando o protocolo do Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EUA). A quantificação do RNA será feita em espectrofotômetro a 260 nm. Então será realizada a síntese do cDNA (Applied Biosystems, Foster City, EUA), correspondente ao conteúdo de RNAm das células. Após será realizada uma PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, EUA) com os primers específicos para determinação do nível de mRNA para os genes de interesse, sendo utilizada a RPS9 como controle endógeno.
Análise Estatística
Os dados obtidos serão analisados no programa estatístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, EUA). As médias serão analisadas através do método MIXED MODELS, considerando o animal, o grupo e o momento da coleta. A comparação de médias individuais será feita através do teste de Tukey-Kramer. Médias pontuais serão analisadas através do método One-way ANOVA. A correlação entre as variáveis será feita através do coeficiente de correlação de Pearson. Serão considerados significativos valores de P<0,05.

O uso de aditivos em dietas de ruminantes é amplamente conhecido e utilizado, sendo de fácil administração, uma vez que o veículo do produto é o próprio alimento do animal. Visto isso, o fácil fornecimento de um aditivo, que auxilie, no controle de quadros clínicos de diarreias em neonatos bovinos e que promova um crescimento animal adequado será uma ótima ferramenta na criação de bezerras holandesas recém-nascidas. O auxilio nos quadros clínicos ira promover a redução de antibióticos nos sistemas produtivos. Por conseguinte, reduzindo às possibilidades dos microrganismos criarem resistência às moléculas de antimicrobianos, da mesma maneira perdas no sistema de produção por mortalidade de bezerras. Por fim o que se espera é que o aditivo melhore o desenvolvimento do trato gastrointestinal e reduza a ocorrência e/ou a severidade dos quadros de diarreia em bezerras leiteiras.