Nome do Projeto
Perfil de sensibilidade, determinação da concentração inibitória mínima de sanitizantes e formação de biofilme de Staphylococcus spp. isolados durante a ordenha
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2020 - 31/08/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O staphylococcus spp. está presente em diversos ambientes, como pele e trato respiratório superior de humanos e animais. É um micro-organismo importante, pois causa diversos prejuízos a nível de saúde pública e por ser comensal de humanos e animais é possível que haja contaminação do leite por esses micro-organismos. Além de fatores de virulência, produção de enzimas e produção de biofilmes, o Staphylococcus é capaz de tornar-se resistente a diversos tipos de antimicrobianos, assim como especula-se a resistência a sanitizantes. Biofilme é um conjunto de células sésseis, ligadas entre si e aderidas a algum substrato ou superfície abiótica, que iniciam a produção de substâncias poliméricas extracelulares, com a função de proteger as células das adversidades do ambiente em que está inserido. A eficiência dos sanitizantes pode ser lesada por muitos fatores, e um deles é a capacidade dos micro-organismos de formar biofilmes. Frente a esse panorama, o trabalho tem como objetivo conhecer o perfil de sensibilidade à meticilina e aos sanitizantes utilizados na ordenha, assim como a capacidade dos isolados de Staphylococcus spp. produzirem biofilme.

Objetivo Geral

Testar a sensibilidade de Staphylococcus coagulase positiva meticilina resistentes frente a sanitizantes e a habilidade de formarem biofilme.

Justificativa

Este trabalho teve início conforme cronograma em anexo, quando cadastrado no sistema cobalto em projetos de pesquisa, durante a execução do trabalho não havia disponibilidade do sanititizante cloraxidine no mercado local, não possibilitando seu teste. Este produto foi disponibilizado recentemente por um fornecedor. No intuito de completar o trabalho solicitamos prorrogação para a realização deste teste. Aproveitando, neste período, foram isolados mais microrganismos do ambiente de ordenha, possibilitando um maior número de testes e assim melhorando o resultado final do trabalho. Em função da interrupção das atividades em março de 2020 por conta da pandemia, nossas atividades laboratoriais foram paradas, impossibilitando a conclusão das análises. Desta forma solicitamos através desse novo cadastro em Projetos Unificados a prorrogação do projeto até 2022 para conclusão total.

Metodologia

Para obtenção de amostras foram realizadas quatro coletas semanais
em 20 propriedades com diferentes sistemas de ordenha (manual, balde ao pé
e mecanizada) acompanhando-se o manejo de ordenha e, com auxílio de
zaragatoa estéril, coletados pontos que poderiam estar envolvidos com a
contaminação do leite cru. Foram coletadas amostras de leite (três jatos iniciais
e leite do conjunto), swab dos equipamentos de ordenha (teteiras no início e no
final da ordenha, tanque, filtro ou coador e balde), das mãos do ordenhador e
dos tetos de 5% do rebanho antes e após pré-dipping. A superfície a ser
coletada, foi delimitada com moldes de polietileno com área de 12cm² e as
zaragatoas transportadas em tubos estéreis contendo 12mL de Água
Peptonada Tamponada (APT), acondicionadas em caixas refrigeradas. Após a
coleta, as amostras foram enviadas para o Laboratório de Inspeção de
Produtos de Origem Animal da Universidade Federal de Pelotas (LIPOA/UFPel)
e imediatamente processadas. As análises foram realizadas conforme as
normas estabelecidas pela IN 62/2003 (BRASIL, 2003), e após contagem de
Staphylococcus coagulase positiva. As amostras produtoras de coagulase
foram armazenadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion) com glicerol 20% à -
20°C.
Para realização do teste de sensibilidade em disco-difusão (BAUER,
1966), as amostras serão previamente recuperadas em BHI e incubadas a
37°C por 24 horas, e então padronizadas em Densidade Óptica 0,500ƛ por
Absorbância em 600nm, semeadas em ágar Mueller-Hinton, adicionados
discos de Cefoxitina 30µg (CFO) e incubados em estufa 37°C por 24 horas. A
escolha do antimicrobiano foi realizada, de acordo com o Clinical and
Laboratory Standards Institute – CLSI (2008). A leitura foi realizada com auxílio
de régua graduada e foi utilizada a classificação para a sensibilidade de
Staphylococcus à CFO, onde halos maiores que 22mm são considerados como
sensíveis e halos menores que 21mm são considerados como resistentes
(CLSI, 2008).
As cepas resistentes à CFO 30µg, serão submetidas, com adaptações,
ao teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Bactericida Mínima (CBM), conforme metodologia descrita no
documento National Committe for Clinical Laboratory Satandards (NCCLS,
2003) e conforme De Bona et al. (2010). Serão testadas substâncias
sanitizantes frequentemente utilizadas em manejo higiênico da ordenha, como:
ácido lático, clorexidina, iodo e hipoclorito de sódio, para verificar a CIM e a
CBM capaz de agir contra as cepas isoladas da ordenha.
Será depositado 100µL de caldo Mueller-Hinton em placas de
microdiluição de 96 poços, da segunda até a 11° coluna serão realizadas
diluições seriadas do sanitizante. As cepas a serem testadas serão distribuídas
(50µL) a partir da segunda até a 12° coluna. Para o preparo do inóculo, as
amostras serão inoculadas em caldo BHI e incubadas 36°C/24h,
posteriormente serão esgotadas em Brain Heart Infusion Agar (BHA) e
incubadas a 37°C por 24 horas. Em seguida, as colônias serão diluídas em
solução salina 0,85% até a concentração 0,5ƛ de absorbância e adicionadas
0,5mL da diluição em 4,5mL de caldo MH.
Serão consideradas como controle negativo a primeira coluna, onde nos
quatro poços superiores irão conter apenas 100µL de caldo MH e os quatro
poços inferiores 100µL de caldo MH + 50µL de sanitizante. E como controle
positivo, será considerada a 12° coluna onde haverá 100µL de caldo MH +
50µL de inóculo.
As microplacas serão incubadas em estufa 37°C/24h, após a leitura será
realizada com base na presença ou ausências de turvação, sendo
convencionado a presença de turvação como crescimento bacteriano e
ausência como não crescimento bacteriano. Dessa forma, será analisado a
menor concentração do sanitizante capaz de causar a inibição do crescimento.
Os ensaios serão realizados em sextuplicata.
A determinação da CBM será realizada conforme Santurio et al. (2007),
onde serão retiradas alíquotas de 10µL a partir dos poços sem crescimento,
semeadas em Mueller-Hinton Ágar e incubadas em estufa 37°C/24h.
As cepas que apresentarem resistência ao CFO serão testadas para
avaliar a capacidade de formação de biofilme em placas, através da
metodologia descrita por Steenackers et al. (2011), com adaptações.
Inicialmente, serão colocados 200µL de caldo Tripticase de Soja (TSB) em
cada poço de uma placa de 96 cavidades, adicionados de 8µL de cultura
overnight em TSB de cada cepa que será testada, padronizadas em
espectrofotômetro com absorbância entre 0,9-1,0 de densidade óptica. Serão
considerados controles cavidades com TSB sem cultura bacteriana. Serão
colocadas as tampas e incubadas a 37°C/48h. Após as tampas serão lavadas
com solução salina tamponada com fosfato e coradas com cristal violeta. Após
lavagem com água destilada estéril, secas a temperatura ambiente por 30
minutos e colocadas em ácido acético a 30%. A leitura será realizada com
auxílio de espectrofotômetro. O resultado será expresso de acordo com as
quatro categorias estipuladas por Stepanovic et al. (2000). O ponto de corte
(DOc) será definido como três desvios padrões acima da média das
densidades óticas (Dos) dos controles e a classificação foi determinada
conforme segue.
DO ≤ DOc = não formadora;
DOc < DO ≤ 2 X DOc = fraca formadora;
2 x DOc < DO ≤ 4 x DOc = moderada formadora;
4 x DOc < DO = forte formadora.

Indicadores, Metas e Resultados

Indicadores: publicações em congressos e revistas.
Metas: conclusão de todas as análises laboratoriais e análise estatística
Resultados esperados: Verificação de concentrações mais adequadas de sanitizantes e identificação da capacidade de formação de biofilmes pelos microrganismos.

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