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O aumento do uso, bem como de áreas agrícolas com culturas resistentes ao glifosato torna necessário avaliar os impactos em organismos não-alvo (Zanuncio et al., 2018) e entender os efeitos letais e subletais de xenobióticos nestes organismos. Uma vez que, as consequências da ação de herbicidas em organismos aquáticos, refletidas em aumento de mortalidade e ocorrência de malformações, principalmente nos primeiros estágios de vida, podem resultar na redução da biodiversidade

Animais experimentais

Ovos embrionados do peixe-rei Odontesthes argentinensis serão coletados na beira da praia (licença ICMBio no. 67433-1) e transferidos para o Laboratório de Fisiologia Aplicada a Aquicultura (UFPel), onde serão incubados conforme proposto em Sampaio e Piedras (2013). Os ovos serão mantidos em incubadoras cilíndrico cônicas de 20L, sob aeração constante, em sistema de recirculação, dotado de filtros mecânico e biológico, temperatura controlada (21oC) e fotoperíodo natural. Cerca de 20% do meio será renovado a cada 48h para manutenção da qualidade da água, quando os ovos gorados e/ou fungados serão descartados. Os ensaios com embriões serão iniciados após 24h de incubação no laboratório, desde que o estágio de epibolia já tenha sido alcançado.

Durante a exposição, sem renovação do meio, a qualidade da água e as concentrações de Roundup transorb® (RT) serão avaliadas mediante o acompanhamento diário das características físico-químicas da água, no sentido de manter níveis adequados de oxigênio dissolvido (>80% de saturação), pH (7,8 - 8,2), dureza (>400mg.L-1) e resíduos nitrogenados nas formas de NH3 (<0,02mg.L-1), NO2- (<0,1mg.L-1) e NO3- (<3,0mg.L-1) e temperatura (21°C), conforme indicado para a espécie em estudo (Sampaio e Piedras, 2013). A análise das variáveis será realizada com equipamento de multiparâmetros, com exceção dos compostos nitrogenados que serão dosados por kits colorimétricos comerciais (Hagen/Nutrafin®). Ao término de cada tempo de exposição uma alíquota da água residual será coletada e armazenada em ultrafreezer para posterior análise do teor de glifosato. Os meios experimentais residuais serão estocados em frascos plásticos para descarte, seguindo as recomendações do Núcleo de Qualidade Ambiental da UFPel para descarte de resíduos biológicos e químicos.


Bioensaios

Ovos embrionados (n=50/réplica), passarão por exposição aguda (24, 48, 72 e 96h), em concentrações de 0,1, 1,0, 10,0, 100,0 e 1000,0mg.L-1 (na base de sal de glifosato). Para todos os tratamentos serão mantidos e amostrados grupos controles não expostos. Todos os tratamentos e controles serão realizados em triplicata. Para o acompanhamento do desenvolvimento embrionário, ao término de cada tempo de exposição, serão avaliados a sobrevivência (%) e freqüência de batimento cardíaco (bat/min) dos embriões, sob observação direta da atividade cardíaca em esteromicroscópio. A frequência cardíaca será monitorada por 30s em embriões escolhidos ao acaso (n=10). Serão tomadas subamostras de embriões para identificação do estágio de desenvolvimento (n=5).

Após a eclosão das larvas, serão realizadas medidas em comprimento total e padrão (0,1mm) e pesadas (0,01g), mediante sedação prévia em eugenol (200mg.L-1) até a morte (parada por mais de 10s do batimento cardiaco) e, posteriormente, repassados ao Biotério da UFPel para descarte


Determinação do Glifosato

A concentração do glifosato será quantificada conforme descrito por Borjesson e Torstensson (2000). A técnica consiste em uma extração líquido/líquido com 150mL de amostra (pH 2,0/HCl). Extração em meio de acetato de etila e acetonitrila (1:1; 3x20mL). A fase aquosa será descartada e a fase orgânica evaporada com nitrogênio e ressuspendida com anidrido trifluoracético e trifluoretanol para a reação de derivatização. Na última etapa a amostra é ressuspendida em acetato de etila e analisada por cromatografia gasosa com detecção fotométrica de chama.


Analise estatística

Os dados serão apresentados na forma de média ± desvio padrão, e aqueles referentes à taxa de eclosão e crescimento serão testados mediante ANOVA. As pressuposições para a ANOVA serão avaliadas pelos testes de Kolmogorov-Smirnov (normalidade) e teste de Cochran (homogeneidade da variância) com emprego do programa Statistica 7.0®. Diferenças significativas entre médias serão determinadas pelo teste a posteriori de Tukey. As médias de sobrevivência (%) serão comparadas pelo teste de Kuskal-Wallis. Todos os testes considerarão um nível de significância de 95% (p<0,05).

 Produção de dados científicos em ecotoxicologia;
 Formação de alunos de iniciação científica;
 Aperfeiçoamento operacional para realização de testes biológicos;
 Divulgação dos resultados em eventos e congressos;
 Publicação de artigos científicos.