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Acredita-se que o principal benefício deste estudo será o esclarecimento da dúvida persistente entre nutricionistas de rebanhos leiteiros do Brasil, de que vacas suplementadas com Boostin® possuem ingestões de matéria seca (MS) muito heterogêneas e erráticas ao longo de um ciclo de aplicação em comparação àquelas suplementadas com Lactotropin®. Isso facilitará o manejo alimentar dos rebanhos e ajudará o nutricionista a escolher e recomendar aos produtores qual das duas formulações melhor se adapta ao rebanho de cada propriedade. Além disso, também serão monitorados metabólitos sanguíneos que ajudarão na compreensão do mecanismo de ação de ambas as formulações de rbST no organismo animal para pesquisas futuras.

Local e Instalações
O experimento será realizado em uma propriedade leiteira comercial no sul do Rio Grande do Sul, no município de Rio Grande. Atualmente, a propriedade possui em torno de 500 vacas lactantes ordenhadas duas vezes ao dia em sala de ordenha do tipo espinha de peixe. Os animais são mantidos em sistema de compost barn, os quais recebem alimentação na forma de TMR, dividida em dois tratos diários.

Separação dos animais
Serão utilizadas 18 vacas secundíparas da raça Holandês, entre 90 e 210 dias em lactação (DEL), média de produção de leite pré-experimental de 36,1 kg/dia, distribuídas aleatoriamente em blocos inteiramente casualizados, em dois tratamentos, diferindo entre si apenas pela forma comercial da rbST administrada. Esses animais serão blocados por média de produção de leite 14 dias antes do início do experimento, dias em lactação e status reprodutivo. Os animais serão distribuídos aleatoriamente para o grupo Boostin® (n=9) ou grupo Lactotropin® (n=9), nos quais receberão uma dose de 500 mg de rbST a cada 14 dias, concluindo 5 ciclos consecutivos de aplicação e 70 dias de período experimental. As injeções do hormônio serão realizadas por via subcutânea, na fossa ísqueoretal.

Avaliações clínicas e zootécnicas
Os exames clínicos serão realizados em todos os animais uma vez a cada ciclo, bem como serão determinados o peso corporal e o escore de condição corporal (ECC). Na avaliação clínica será realizada a ausculta da frequência cardíaca, frequência respiratória, movimentos ruminais, aferição da temperatura retal, visualização da coloração de mucosa e o tempo de preenchimento capilar. O ECC será realizado por dois avaliadores treinados e independentes através da escala de 1 a 5 (1= muito magra e 5= muito gorda) (Wildman et al., 1982). O peso será estimado através de fitamétrica de pesagem bovina, posicionada posterior à articulação escápulo-umeral, para determinar a circunferência do perímetro torácico. As produções de leite diárias serão medidas eletronicamente pelo software DelPro™ (DeLaval® ) para cada ordenha durante os 70 dias experimentais. As coletas de leite serão realizadas no 4° e 11° dias dos 5 ciclos de aplicação, em frascos contendo conservante bronopol. As amostras serão mantidas refrigeradas e, posteriormente, serão enviadas ao Laboratório Centralizado de Análise de Leite, na Associação Paranaense dos Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (APCBRH), para análise dos constituintes do leite (teores de gordura, proteína, lactose, sólidos totais, caseína e nitrogênio ureico) e contagem de células somáticas (CCS).

Coletas e análises bioquímicas
Amostras de sangue serão coletadas no 1º, 4º e 7º dias de cada ciclo após a ordenha da manhã. As coletas de sangue serão realizadas através de punção da veia ou artéria coccígea, em tubos com ativador de coágulo para avaliação dos níveis circulantes de ácidos graxos não esterificados (AGNE), albumina e β-hidroxibutirato (BHB). Para análise de glicose, será coletado sangue em tubo contendo o anticoagulante fluoreto de sódio. Imediatamente após a coleta, as amostras de sangue serão centrifugadas a 3.500 rpm durante 10 minutos para obtenção do soro e plasma. Posteriormente, as amostras serão acondicionadas em microtubos de 1,5 ml, do tipo eppendorf (em duplicata) e congeladas. As amostras de sangue para a realização do hemograma serão coletadas em tubo contendo o anticoagulante EDTA, no dia 7 de cada ciclo de aplicação. As análises de albumina, glicose, AGNE e BHB serão realizadas através de kits comerciais. As leituras das amostras do perfil proteico e energético serão determinadas através de analisador bioquímico automático (Labmax Plenno ®).

Comportamento alimentar
A avaliação do consumo e comportamento alimentar dos animais será obtida diariamente durante o período de 24 horas por dia, através de alimentadores inteligentes (Intergado® ), de forma automática e individualizada. O comportamento animal será avaliado através de coleiras de monitoramento (ChipInside® ) individuais que indicarão diariamente o tempo de atividade, ruminação e ócio (minutos/dia) dos animais.

Coleta de amostras de alimentos e análises bromatológicas
Para a estimativa do teor de matéria seca da dieta e para determinação do consumo serão coletadas diariamente 100g de amostra de silagem de milho e de pré-secado (uma vez ao dia) e de TMR (duas vezes ao dia, nos períodos da manhã e da tarde). As análises dos teores de matéria seca dos volumosos e da TMR serão realizadas através do medidor de umidade Koster (Koster Moisture Tester Inc., Brunswick, EUA). Durante todo o período experimental serão coletadas amostras semanais (duas vezes na semana) de silagem e pré-secado (± 300g), através de uma amostragem de cinco pontos diferentes dos silos para realização das análises bromatológicas. Diariamente, será coletada uma pequena porção da TMR da manhã e da tarde para composição do pool semanal para análise bromatológica. Posteriormente, as amostras de alimentos serão encaminhadas até o Laboratório de Nutrição do Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária (NUPEEC-UFPel, Pelotas, Campus Capão do Leão) onde será realizada a pré-secagem dos alimentos em estufa de circulação forçada a 55°C, por 72 horas. Após a pré-secagem, as amostras serão moídas em moinho de facas. Para análise da matéria seca definitiva, as amostras moídas serão colocadas em estufa a 105°C, por no mínimo 8 horas (Easley et al., 1965). Em seguida, serão pesadas e levadas até a mufla onde permanecerão por 3 horas, a 600°C para cálculo de matéria orgânica e matéria mineral, sendo pesadas a seguir, após estarem em temperatura ambiente (AOAC, 1995). A análise para determinação de proteína bruta será realizada através do método descrito por Kjeldhal (AOAC, 1995) para determinação de nitrogênio, modificado por utilizar uma solução de ácido bórico a 4% (p/v) como receptor de amônia livre durante a destilação, uma solução de 0,2% (p/v) de verde de bromocresol e 0,1% (p/v) de vermelho de metila como indicador e uma solução padrão de ácido sulfúrico para titulação, conforme descrito por Kozloski et al. (2003). As análises de fibra em detergente neutro, de fibra em detergente ácido (FDA), corrigidas por cinzas e lignina em detergente ácido (LDA), serão determinadas segundo Van Soest & Robertson (1985). O nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN) e o nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA) serão determinados de acordo com Licitra et al. (1996).

Temperatura interna
Os dados de temperatura interna serão mensurados através de termômetros portáteis (iButton® , Thermodata Viewer, EUA) acoplados a dispositivos intravaginais, que registrarão a temperatura vaginal em um intervalo de 30 minutos.

Análise estatística
Os dados serão analisados pelo procedimento MIXED para medidas repetidas no programa estatístico SAS (SAS versão 9.4 Institute Inc., Cary, EUA), incluindo blocos, tratamento, tempo (dias ou semanas) e suas interações como efeitos fixos e vaca dentro de bloco como efeito aleatório. Os dados coletados anteriormente ao início do experimento serão utilizados como covariável. O nível de significância admitido será de P<0,05.

Avaliar a variabilidade diária na ingestão alimentar de vacas leiteiras em lactação, tratadas com duas formas comerciais de rbST a fim de responder uma dúvida muito comum entre nutricionistas de bovinos leiteiros e produtores do país, que acreditam que vacas tratadas com Boostin® têm ingestão alimentar oscilante e irregular ao longo de um ciclo de aplicação, o que dificultaria o manejo alimentar dos rebanhos.