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A abundância de animais admitidos em centros de reabilitação de vida selvagem oferece uma oportunidade única para atividades de pesquisa que abordam microrganismos patogênicos (Yabsley, 2019). A presença de animais portadores patógenos em um centro de reabilitação de vida selvagem representa uma ameaça tanto para os animais quanto para os humanos que entram em contato com eles ou com o ambiente contaminado. No entanto, pouco se estudou sobre as espécies de animais silvestres capazes de atuar como portadores de patógenos responsáveis por doenças bacterianas (Tompkins et al., 2015), o que dificulta a adoção de medidas preventivas nas instalações que admitem esses animais.
A espécie Sus scrofa (javali) é uma das mais comuns do mundo dentre os mamíferos silvestres. No Brasil é amplamente difundido em quase todo o país, e nos últimos anos sua população tem aumentado constantemente. Os javalis estão presentes em 22 dos 27 estados brasileiros, embora poucos locais tenham estimativas populacionais (Brasil, 2017). Existem muitas ocasiões de interação entre javalis e humanos, ocasionadas pela busca do animal por alimento e especialmente pela caça. Nestas circunstâncias, javalis frequentemente também entram em contato com animais domésticos (Barth et al., 2018), podendo servir como fonte de contaminação tanto para estes e para animais silvestres, quanto para seres humanos caso portem microrganismos patogênicos (Meng et al., 2009).
De acordo com Croxen et al. (2013) a espécie Escherichia coli é mais frequentemente reconhecida pela capacidade de causar diarreia e é encontrada predominantemente no trato gastrointestinal, mas também tem a capacidade de causar doenças extra intestinais significativas. Os patotipos de E. coli são variantes patogênicas que causam alta morbidade e mortalidade em todo o mundo. Consequentemente, E. coli patogênica é amplamente estudado em humanos, animais e meio ambiente. O curso da doença, o desencadeamento dos sinais clínicos e as complicações variam significativamente entre patotipos, sendo que alguns constituem grande relevância em saúde única, pois têm baixas doses infectantes e são transmitidos por meios onipresentes, como alimentos e água. Embora nem todos os patotipos representem a mesma importância em saúde única, caso contenham genes de patogenicidade, representam potencial para causar doenças e apresentam desafios à saúde humana e animal (Croxen et al., 2013).
Jobbins e Alexander (2012) após analisarem 150 amostras de fezes de animais silvestres africanos verificaram que 41,3% continham E. coli, sendo estes isolados resistentes a antibióticos. Os autores sugerem que os impactos do uso de antimicrobianos podem ir muito além dos locais de prescrição dos antibióticos e animais silvestres podem servir como reservatório de bactérias resistentes, e assim, fontes de disseminação destes microrganismos no ambiente.
Alguns estudos relatam animais silvestres como portadores de E. coli patogênicas. Bublitz et al. (2014) após pesquisa de várias bactérias, inclusive E. coli, em amostras de fezes de lêmuris em diferentes habitats, que a proximidade com animais domésticos e humanos foi decisiva para a ocorrência destas bactérias nas espécies estudadas. No Brasil, foram apontados como reservatório de E. coli, espécies de morcegos capturados em área protegida da Floresta Atlântica no Sudeste. As respostas de 20 isolados de E. coli frente aos antibióticos testados foram variáveis, 16 dos isolados (80%) eram sensíveis a maioria dos antibióticos, um isolado (5%) foi resistente à ampicilina, um isolado (5%) foi resistente à ampicilina e cefalexina, e dois (10%) foram resistentes a amoxicilina-clavulanato, ampicilina e cefalexina (Cláudio et al, 2018). Gomes es al. (2011) após pesquisa de enterobactérias de mamíferos silvestres em criadouro
conservacionista em Palmas, TO, relataram o isolamento de E. coli em um Cerdocyon thous. Estes estudos demonstram resultados obtidos em populações de animais silvestres específicas e deixaram clara a ocorrência de E. coli em animais silvestres, sendo necessários mais estudos por região e em outras espécies para a compreensão da distribuição e características destes patógenos, com a finalidade de adoção de medidas de controle e tratamento eficientes.
Além destes, outros estudos destacam a importância da caracterização dos isolados. De acordo com Bertelloni et al. (2020) dados sobre o papel dos javalis como portador de patotipos de E. coli resistentes a antimicrobianos ainda são escassos. Os autores pesquisaram o patógeno em javalis na região de Toscana da Itália. E. coli foi isolada de 175 de 200 animais. Em relação aos genes de patogenicidade, os mais detectados foram hlyA (47,4%), astA (29,1%), stx2 (24,6%), eaeA (17,1%) e stx1 (11,4%). E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) foi detectada em 21,7% das amostras, E. coli enterohemorrágica (EHEC) em 6,3% das amostras, E. coli enteroagregativa (EAEC) em 5,1%, e E. coli enteropatogênica (EPEC) em 3,4%. As maiores taxas de resistência foram contra cefalotina (94,3%), amoxicilina com clavulanato (87,4%), ampicilina (68,6%) e tetraciclina (44,6%). Os resultados mostram que javalis podem carrear E. coli patogênica e resistente a antimicrobianos, representando um possível reservatório e fonte de transmissão para animais domésticos e humanos na Itália.
Sanches et al. (2017) realizaram o diagnóstico molecular da ocorrência de patotipos de E. coli patogênicas em 10 diferentes ordens de aves silvestres de cativeiro no estado de São Paulo, Brasil. Foram analisadas amostras fecais de 516 aves pertencentes a 10 ordens. Após o isolamento de 401 cepas de E. coli, estas foram submetidas à PCR multiplex para pesquisa dos genes eae e bfp do patotipo EPEC, stx1 e stx2 do patotipo STEC. Os resultados destes testes revelaram que 23/401 (5,74%) isolados possuíam o gene eae, 16/401 possuíam o gene bfp (3,99%) e 3/401 possuíam o gene stx2 (0,75%) distribuídas entre as ordens de Psittaciformes, Strigiformes e Columbiformes. Esses autores revelam a infecção por STEC, EPEC típica e atípica em aves em cativeiro no Brasil. Os dados sugerem o potencial risco à saúde pública que essas aves representam como reservatórios de E. coli patogênicas.
Quanto a relatos em répteis, Bautista-Trujillo et al. (2020), relataram a ocorrência de E. coli patogênicas no intestino de 100 de 240 (41,7%) iguanas verdes de cativeiro. Isolados patogênicos foram identificados em 25,9% da população pesquisada e foram detectadas na maioria (62%) dos répteis portadores das cepas de E. coli. O patotipo STEC, com isolados portadores do gene stx1, foi o mais prevalente (38,7%), seguido por EAEC e ETEC (27,4% cada). O teste de sensibilidade a antimicrobianos demonstrou que uma alta proporção de cepas patogênicas era resistente à carbenicilina, amicacina e ampicilina. Concluíram com este estudo que a iguana verde mantida em cativeiro é portadora de E. coli patogênicas, com resistência a antibióticos de primeira linha, incluindo penicilinas. De acordo com esses autores, répteis representam uma fonte potencial de transmissão para humanos suscetíveis, portanto uma fonte potencial de doenças gastrointestinais.
Conhecer as espécies de animais silvestres que podem albergar patotipos de E. coli, com potencial patogênico, bem como o conhecer o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos dos isolados é fundamental para um melhor entendimento da sua epidemiologia e tratamento. Estes dados servem como base para o controle da transmissão de E. coli, prevenção e cura das doenças causadas por esta enterobactéria.

1) Coleta das amostras de animais silvestres em reabilitação

Durante o período de um ano, serão realizadas quatro coletas dos animais alojados no NURFS, distribuídas nas quatro estações do ano. Será um estudo observacional, seccional, censitário. Os dados origem do animal (apreensão ou resgate) e local da captura (ambiente rural ou urbano) serão coletados. Os animais serão identificados taxonomicamente conforme a Lista Anotada dos Mamíferos do Brasil (Paglia et al., 2012), a Lista comentada das aves do Brasil pelo Comitê Brasileiro de Registros Ornitológicos (Piacentini et al., 2015) e Répteis brasileiros: lista de espécies 2015 (Costa e Bérnils, 2015). As coletas de fezes serão realizadas diretamente do reto ou cloaca, conforme o caso, utilizando zaragatoas estéreis umedecidas em solução salina 0,85%, as quais serão colocadas em tubos contendo 1 mL de Água Peptonada Tamponada (APT, Mumbai, Índia) e imediatamente encaminhadas ao laboratório em caixas isotérmicas com gelo.


2) Coleta das amostras de S. scrofa de vida livre

Durante o período de um ano, serão realizadas coletas de S. scrofa capturados na região sul do Rio Grande do Sul, obtidos por conveniência, amostragem por conveniência, considerando a colaboração ativa de caçadores e responsáveis pelo manejo desses animais. O dado área de captura será coletado para cada animal. As coletas de fezes serão realizadas diretamente do reto, utilizando swabs estéreis umedecidas em solução salina 0,85%, os quais serão colocadas em tubos contendo 1 mL de APT e encaminhados ao laboratório assim que possível em caixas isotérmicas com gelo.


3) Obtenção dos isolados de E. coli

As zaragatoas e swabs com as amostras serão diretamente semeados por esgotamento em ágar MacConkey (Acumedia, Lansing, Michigan, USA). Após incubação a 37 ºC por 24 h, três colônias lactose positivas e três lactose negativas, uma vez que alguns patotipos de E. coli não fermentam lactose ou fermentam tardiamente, serão semeadas em Infusão de Cérebro e Coração (BHI, Acumedia) e, após incubação a 37 ºC por 24 h, uma alçada dos cultivos será repicada para caldo Fluorocult (LMX, Merck, Alemanha) e incubados à 37 ºC por 24 h, isolados que apresentarem fluorescência neste meio quando submetido a luz UV, terão seus cultivos em BHI estocados com 20% de glicerol a -20 ºC. Os isolados serão recuperados em BHI a 37 ºC por 24 h, quando necessário.


4) Extração de DNA

O DNA dos isolados será extraído conforme Sambrook e Russel (2001). Resumidamente, o pellet obtido por centrifugação de 1 mL da cultura bacteriana será ressuspendido em 100 µL de tampão STES [Tris-HCl 0,2 M, NaCl 0,5 M, SDS 0,1% (m/v), EDTA 0,01 M, pH 7,6]. Serão adicionados 50 µL de pérolas de vidro e 100 µL de fenol/clorofórmio. Após homogeneização por 1 min, a mistura será centrifugada a 13.000 g por 5 min. O sobrenadante será coletado e precipitado em 2 volumes de etanol absoluto e 0,1 volume de NaCl 5 M a -70 ºC por 30 min. Uma nova centrifugação será realizada a 13.000 g por 20 min, o sobrenadante será descartado e o pellet lavado com etanol a 70%. Após eluição em 40 µL de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4). O DNA extraído será estocado a -20 ºC.


5) Confirmação da espécie, determinação de patotipos e identificação dos genes de patogenicidade

A confirmação molecular da espécie E. coli será realizada por PCR convencional, com o uso primers específicos para o gene malB de acordo com o descrito por (Wang et al., 1996) (Tabela 1). Resumidamente cada reação de 25 µL irá conter 2 U de Taq DNA polimerase recombinante (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems), 200 µM de desoxinucleosídeo trifosfato (dNTP), DNA (aproximadamente 100 ng) e primers.
As condições da amplificação serão: 95 ºC por 15 min, seguido por 30 ciclos a 95 ºC por 30 s, 55 ºC por 45 s e 72 ºC por 45 s; e uma extensão final a 72 ºC por 10 min. Será utilizada como controle positivo a cepa de E. coli ATCC 25922. Um controle negativo será incluído a cada amplificação. Os fragmentos amplificados por PCR serão submetidos a eletroforese com gel de agarose a 1,0% e visualizados em luz ultravioleta após coloração com Blue Green (LGC Biotecnologia, Cotia, Brazil).
Os patotipos STEC, EAEC, EPEC, ETEC e EIEC os genes de patogenicidade stx1, stx2, astA, aggR, pic, bfpB, elt, estIa estIb e invE, serão determinados de acordo com o protocolo de Multiplex PCR descrito por Müller et al. (2007) com modificações, já que nem todos os genes serão pesquisados (Tabela 1). A determinação do patotipo EHEC, genes eae e hlyA, será realizada conforme Oswald et al. (2000) (Tabela 1). Resumidamente cada 25 µL da reação irá conter 2 U de Taq DNA polimerase recombinante (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems), 200 µM de desoxinucleosídeo trifosfato (dNTP), DNA (aproximadamente 100 ng) e primers. As condições da amplificação serão: 94 °C por 5 min, seguida de 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 63 °C por 30 s e 72 °C por 1,5 min; e uma extensão final a 72 °C por 5 min. Os fragmentos amplificados por PCR serão submetidos a eletroforese com gel de agarose a 2,0% e visualizados em luz ultravioleta após coloração com Blue Green (LGC Biotecnologia, Cotia, Brazil) (Müller et al., 2007).
Serão utilizadas como controle positivo as cepas 43895 (STEC), 25922 (EAEC), INCQS 00182 (EPEC), 26555 (ETEC), ATCC 43893 (EIEC) e ATCC 43895 (EHEC) e como controle negativo a cepa ATCC 25922 (E. coli apatogênica).


6) Avaliação da susceptibilidade frente a antimicrobianos

O método de difusão em disco será empregado para determinar a resistência aos seguintes antimicrobianos: cefotaxima (30 mg), amoxicilina com clavulanato (20-10 mg), ampicilina (10 mg), tetraciclina (30 mg), gentamicina (10 mg), sulfametoxazol-trimetoprima (25 mg), cloranfenicol (30 mg), cefoxitina (30 mg), cefalotina (30 mg), enrofloxacina (10 mg), gentamicina (10 mg), estreptomicina (10 mg), imipenem (10 mg) e aztreonam (30 mg), amicacina (30 mg), ceftazidina (30 mg), ceftriaxona (30 mg) e cefalexina (30 mg) (Kairosafe Srl, Trieste, Itália). O teste de resistência antimicrobiana será realizado em placas de ágar Mueller-Hinton incubadas em 37 ºC por 24 h e interpretado de acordo com o estabelecido pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015).


7) Análise estatística

Será calculada a prevalência e seu intervalo de confiança a 95% dos patotipos de E. coli e do perfil de resistência frente a antimicrobianos, de acordo com Brown et al. (2001), por meio da calculadora epidemiológica Epitools (Sergeant, 2018). Alem disso, a fim de verificar a associação da prevalência com a estação do ano, origem, local da captura, classe e espécie de animal, serão aplicados testes de qui-quadrado, considerando um intervalo mínimo de confiança de 95%.

Verificar a ocorrência de patotipos de E. coli em animais silvestres e javalis de vida livre do sul do Rio Grande do Sul até dezembro de 2022.
Identificar espécies de animais silvestres que possam ser portadores de E. coli até dezembro de 2022.
Identificar os patotipos de E. coli que ocorrem em animais silvestres em reabilitação e javalis de vida livre até dezembro de 2022.
Comparar a ocorrência dos patotipos de E. coli em animais silvestres nas quatro estações do ano até dezembro de 2022.
Identificar genes de patogenicidade presentes nos isolados até dezembro de 2022.
Testar a susceptibilidade dos isolados frente à antimicrobianos e correlacionar o local de captura dos S. scrofa portadores de E. coli com os patotipos e características dos isolados até fevereiro de 2023.
Confecção de material para ser publicado em eventos científicos, como simpósios e congressos da área, bom como artigos científicos até maio de 2023.