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Os produtos cárneos são alimentos fundamentais na dieta da população de modo geral, fornecendo nutrientes essenciais como proteínas, vitaminas e minerais, sendo considerados uma das principais fontes proteicas usadas na alimentação humana. O aumento da renda per capita da população e a crescente urbanização, resultam num maior consumo de alimentos de origem animal (MANESSIS et al., 2020). Segundo as projeções do Ministério de agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA), o setor de carnes aponta um crescimento nos próximos anos. As taxas de crescimento de produção no período de 2020/21 a 2030/31 para carnes suínas devem ter um crescimento anual de 3,0%, para carne bovina de 2,3% e para carne de frango 2,6%. Além de um aumento de produção de 24,0% (DA SILVA et al.,2021; MAPA,2020). Os sais de cura constituídos por nitritos e/ou nitratos de sódio são usados para conservação e para alteração de características sensoriais em produtos cárneos, suas vantagens incluem a formação de cores de cura exclusivas, promoção do sabor, potencial antioxidante e propriedades antimicrobianas. Apesar destas vantagens, os sais de cura em determinadas situações podem gerar alguns riscos à saúde dos consumidores, sendo a redução ou remoção do nitrito e nitrato uma situação crítica para indústria de produtos cárneos. As nitrosaminas e outros produtos de reação formados a partir de nitrito e nitrato estão associados ao aumento do risco de câncer. Em vista disso, são necessárias alternativas para substituição parcial ou total do nitrato e nitrito em produtos alimentícios (PAPADOCHRISTOPOULOS et al.,2021).
Há um interesse crescente das indústrias de alimentos em desenvolver e usar aditivos naturais que atendam às demandas dos consumidores por produtos saudáveis, mas que mantenham a segurança e o valor nutricional e atuem como conservantes prolongando a vida útil, mantendo a qualidade microbiológica e sensorial dos produtos alimentícios. Nesta situação, a utilização de substâncias bioativas como óleos essenciais, surge como uma alternativa para substituição aos aditivos químicos sintéticos e este fato tem ganhado grande atenção na última década (LAGES, 2019; FALLEH et al.,2020).
Os óleos essenciais são substâncias naturais derivadas do metabolismo especializado de plantas, ricos em diferentes compostos, como terpenos e fenilpropanoides, e podem manter a qualidade dos alimentos através da inibição de microrganismos. Os compostos constituintes não polares presentes nos óleos essenciais têm uma solubilidade em água relativamente baixa, além de conferir propriedades sensoriais e apresentarem baixa toxicidade em relação aos conservantes sintéticos, podendo ser utilizados na indústria alimentícias como aromatizantes, devido ao seu aroma destacado, vinculando sabores, podendo ainda contribuir como um antimicrobiano natural (LAGES, 2019; FALLEH et al.,2020). Considerando a carne e seus derivados como sistemas alimentares complexos, é fundamental garantir a eficiência da aplicação de óleos essenciais como antimicrobianos naturais, sendo importante conhecer as propriedades e constituintes químicos dos óleos essenciais, a microbiota contaminante, a concentração inibitória mínima contra microrganismos específicos, as possíveis interações de seus constituintes químicos com a matriz alimentar e as alterações sensoriais que podem ocorrer, principalmente devido à capacidade aromatizante (LAGES, 2019; DA SILVA et al., 2021; PAPADOCHRISTOPOULOS et al.,2021).
O óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris L.) é um dos óleos que apresentam comprovada atividade antimicrobiana. Sendo uma planta herbácea, da família Lamiaceae, com origem no Mediterrâneo Ocidental. Têm sido amplamente utilizado nas áreas alimentícia, médica e cosmética devido ao seu odor e sabor agradáveis e possui forte atividade inibitória contra muitos patógenos de origem alimentar ou bactérias deteriorantes, como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhimurium. Atributos esses que podem estar relacionados à presença de timol e seu isômero (carvacrol), b-cariofilos, c-terpineol, e p-cimeno presentes no óleo (FRAQUEZA et al.,2021; LIU et al.,2020; ALMASI et al., 2021). Apesar do seu grande potencial antimicrobiano os óleos essenciais, quando utilizados diretamente nos alimentos, podem interferir negativamente nas características sensoriais dos produtos, podendo inclusive diminuir a sua aceitação, sendo necessário utilizar estratégias para aplicação dos mesmos. A encapsulação de substância fenólicas tem sido investigada como uma estratégia de aplicação, em que novos sistemas de liberação são utilizados como veículo para incorporação, transporte, proteção e liberação controlada de compostos bioativos, assim melhorando sua utilização, dispersão e estabilidade. Entre as abordagens de encapsulamento tradicional as microemulsões e nanoemulsões se destacam como sendo apropriados para utilização na indústria de alimentos (GARANVAND et al.,2021; ALMASI et al., 2021; FELÍCIO,2020). As nanoemulsões (NEs) são sistemas coloidais, cineticamente estáveis, sua formação requer alta energia mecânica. Diferente das microemulsões que são termodinamicamente estáveis, sendo consideradas uma emulsão óleo/água com tamanho médio de gotícula que varia de 50 a 1000 nm. As microemulsões normalmente requerem altas concentrações de surfactante, enquanto as nanoemulsões podem ser formuladas a partir de uma gama mais ampla de ingredientes e requerem concentrações mais baixas de surfactante. As principais diferenças entre as nanoemulsões e microemulsão são a estabilidade termodinâmica e o diâmetro da gotícula (ALMASI et al., 2021; RADI et al.,2018). Por terem um processo de obtenção simples e possuir uma alta estabilidade contra floculação, agregação, coalescência e amadurecimento de Ostwald as nanoemulsões atraem mais atenção. Já as microemulsões não são muito utilizadas para aplicação em alimentos, devido a algumas desvantagens operacionais e por apresentar uma emulsificação de baixa energia (FELÍCIO, 2020; GARANVAND et al.,2021). A utilização de substâncias que promovam a cor em produtos cárneos é de extrema importância, sendo que a cor é um dos principais atributos notados pelos consumidores na hora da compra e está diretamente relacionada com a aceitação do produto. O uso de corantes artificiais não é desejado pelos consumidores, que buscam cada vez mais ingredientes naturais nos produtos. Além de que a utilização de certos corantes artificiais, em determinadas situações, pode ocasionar em doenças, como hiperatividade em crianças e até problemas carcinogênicos. Portanto, a utilização de corantes naturais tem sido amplamente estudada visando a aplicação em alimentos. Dentre os corantes naturais destaca-se o presente na beterraba, sendo um dos mais utilizados na indústria de alimentos por ser de fácil extração e conter um alto poder de coloração (LAGES,2019; MEIRELES et. al.,2020). O extrato de beterraba é uma boa alternativa para utilização em produtos cárneos, sendo que as betalaínas são pigmentos nitrogenados encontrados em abundância nesta hortaliça. As betalaínas são compostos hidrossolúveis, derivadas do ácido betalâmico, obtidas através da extração aquosa da beterraba vermelha triturada, este método tem um alto rendimento e baixa degradação. Podendo ser classificadas em betacianinas, responsáveis pela coloração vermelho-violeta e em betaxantinas, de coração vermelho-alaranjado, porém em menor proporção. Contudo, sua instabilidade em altas temperaturas e pH alcalino limita sua aplicação como corante alimentar (SANTOS, 2017; BELLUCCI, 2018).
Diante do contexto exposto, acredita-se que a adição conjunta de nanoemulsões de óleo essencial de tomilho e extrato de beterraba em substituição aos sais de cura, represente uma alternativa natural para produção de embutidos cárneos, propiciando a manutenção das características físico-químicas, microbiológicas e sensoriais.

Material
Será utilizado o óleo essencial de tomilho branco (Thymus vulgaris L.), obtido comercialmente da empresa Ferquima, Indústria e Comércio de Óleos Essenciais, acondicionado em frasco âmbar, lacrados, com volume total de 100 mL. As beterrabas e os demais ingredientes para formulação dos embutidos cárneos serão obtidos em estabelecimentos comerciais da cidade de Pelotas, RS.
Obtenção do extrato de beterraba
A obtenção do extrato de beterraba será de acordo com a metodologia utilizada por Lages et al. (2019), o suco de beterraba será extraído em extratora de suco (Juicer Compact Philips Walita, Brasil) e posteriormente liofilizado (Liotop L-101 – Liobras, Brasil) por 48horas para obtenção do concentrado em pó e após serão armazenados em freezer até o momento da análise.
Avaliação do concentrado em pó
Umidade
A determinação do teor de umidade será através de secagem em estufa a 105 ºC (AOAC, 2016).
Teor de açúcar (redutores e totais)
A determinação de açúcares redutores (AR) e açúcares totais (AT) será realizada pelo método de Lane-Eynon, segundo descrição das Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
Sólidos solúveis
O pó liofilizado de extrato de beterraba será reintegrado, após homogeneizado para realização das análises de sólidos solúveis totais (ºBrix) a leitura será realizada em refratômetro de bancada do tipo Abbé (Quimis model Q-109B, Brasil), corrigido para 20ºC (AOAC, 2016).
Cor
Para determinação de cor será utilizado um colorímetro Minolta CR 400, através do sistema de leitura CIELAB (ComissionInternatinale de E'clairage), O Chroma é o índice de saturação e descreve a intensidade de uma cor, é calculado através da equação C* = √((〖a*〗^2+〖b*〗^2)). O ângulo Hue é o ângulo de tonalidade, indica a posição de amostra no diagrama de cromoticidade, é calculado através da equação H* = 〖tang〗^(-1) ((b*)/(a*)) (BELLUCCI, 2018).
pH
O pó liofilizado de extrato de beterraba será reintegrado com água destilada, após homogeneizado, para realização das análises de pH em potenciômetro (Digimed pHmetro DM-20) (AOAC, 2016).
Preparo da nanoemulsão de óleo essencial de tomilho
A fase oleosa da nanoemulsão será o óleo essencial de tomilho, enquanto a fase aquosa será água Milli-Q, como surfactante, será utilizado Tween 80 . Pretende-se utilizar uma composição em que a fase oleosa seja de 10% (m/m), dispersa na fase aquosa 90%, da qual 1% (m/m) corresponderá ao emulsificante.
A fase oleosa será dispersa na fase aquosa e efetuada homogeneização em Ultra Turrax (Modelo IKA T10 Basic) a 21.100 rpm por 3 min, seguida de Ultrassom (Modelo QSonica-Q700) a 40% de amplitude por 5 min. A metodologia utilizada seguirá as recomendações de Guo et al. (2020) e Yang et al. (2022), com modificações.
Análise do tamanho de gota, índice de polidispersividade e potencial zeta
Nas nanoemulsões resultantes, serão efetuadas análises com relação ao tamanho das gotas, índice de polidispersividade e potencial zeta (ζ), 24 h após a homogeneização. As emulsões serão avaliadas por espalhamento de luz dinâmica, utilizando o equipamento Litesizer 500 (Anton Paar, Brasil) conforme Wan et al. (2019).
Preparação do embutido cárneo
Os embutidos cárneos serão elaborados no laboratório de Processamento de Alimentos de Origem Animal do Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, de acordo com a formulação padrão. Além dos ingredientes utilizados na formulação controle, as formulações serão adicionadas de nanoemulsão de óleo essencial de tomilho e extrato de beterraba na proporção de 0,5% e 1,5%, respectivamente, usando como referência os valores utilizados por Lages (2019).
A massa cárnea resultante será embutida em tripa natural suína, em embutideira elétrica, e as linguiças serão acondicionadas em porções, identificadas e armazenadas a 7°C.
Avaliação físico-química
Índice de acidez (IA)
A determinação do IA será verificada de acordo com AOCS Ca 5a-40 (2003). A
Índice de peróxido (IP)
A determinação do IP será verificada de acordo com AOCS Cd 8-53 (2003).
Análise de cor
Será conforme descrito no anteriormente.
Análise de umidade
A umidade será realizada por meio do determinador rápido (Marte, ID50, Brasil), utilizando 10 g de amostra e temperatura constante (105 ºC), sendo o final da análise determinado pela manutenção do peso por 30 segundos. O resultado foi expresso em %.
Avaliação microbiológica
Os produtos após elaborados de acordo com os tratamentos serão mantidos em temperatura de refrigeração (<7 ºC) por até dez dias. A partir de cada um dos produtos será retirada uma amostra de 25 g em quatro tempos, logo após a elaboração do produto, três dias após a elaboração dos produtos, sete dias após a elaboração e dez dias após a elaboração. Estas amostras serão submetidas a avaliação frente aos microrganismos preconizados pela IN nº 60, que são Salmonella spp., Escherichia coli, Microrganismos aeróbios mesofilos e Listeria monocytogenes.
Análise Sensorial
O teste de aceitação e de intenção de compra será realizado nas formulações dos embutidos que serão submetidos a cocção. Análise sensorial dos embutidos será realizado no Laboratório de Análise Sensorial, na Universidade Federal de Pelotas. Os participantes que aceitarem participar do estudo irão assinar um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina na Universidade Federal de Pelotas.
O teste de Aceitação será aplicado com no mínimo 50 (cinquenta) avaliadores, utilizando-se escala hedônica de 9 pontos, variando de “desgostei muitíssimo” (1) à “gostei muitíssimo” (9), com os atributos de impressão global, sabor, odor e cor. Serão servidas porções de 10 g em pratos de porcelana branca e codificadas com três dígitos aleatórios (GULARTE, 2009).
O teste de intenção de compra será realizado utilizando-se escala estruturada de cinco pontos, variando de “certamente não compraria” ( nota 1) a “certamente compraria” (nota 5). As amostras serão servidas em cabines individuais sob luz branca, em pratos de porcelana, com codificação de três dígitos aleatórios. A ordem de apresentação será inteiramente casualizada (GULARTE, 2009).
Análise Estatística
Será aplicada uma análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Fisher de Mínima Diferença Significativa (LSD test) para verificar se existirão diferenças significativas (p<0,05) entre as formulações utilizadas em relação a inibição microbiana, e para avaliar as diferenças nas características físico-químicas e sensoriais, será aplicado o teste de Tukey, ao nível (p<0,05), utilizando o programa Statistix 10.

Espera-se com este estudo que a utilização conjunta da nanoemulsão de óleo essencial de tomilho e de extrato de beterraba apresente efeito antimicrobiano frente as bactérias Salmonella, Escherichia coli, Aeróbios mesófilos e Listeria monocytogenes e evite a perda da coloração causada pela redução de nitrito, mantendo ou até melhorando a coloração do produto, sem afetar a estabilidade físico-química. Também, que estes resultados sejam uma alternativa promissora para substituição de conservantes químicos artificiais em embutidos cárneos, diminuindo riscos à saúde e atendendo as necessidades e expectativas dos consumidores.