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A hipertensão pulmonar é uma doença sem cura e seu tratamento foca principalmente em atenuar a sintomatologia. Esse é realizado costumeiramente com fármacos que atuam sobre a maquinaria do cálcio, a biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), a prostaciclina e a endotelina-1. Dentre outros, destaca-se a sildenafila, medicamento que potencializa a ação do NO promovendo vasodilatação. Apesar das crescentes descobertas medicamentosas e do aprofundamento científico sobre o tema, a HAP é uma doença de diagnóstico tardio e sem cura. Os fármacos mais utilizados no seu tratamento, além de diversos efeitos colaterais, não são eficazes em grande parte dos pacientes. Sendo assim, é fundamental a busca por alternativas adjuvantes ao tratamento convencional que possam auxiliar na melhora da qualidade de vida desses pacientes. Neste contexto, a restrição calórica pode ser uma aliada por mitigar a progressão do estresse oxidativo e da inflamação [1]. De fato, tem sido mostrado um papel promissor da RC no combate a diversas injúrias como, por exemplo, doenças cardiovasculares, síndrome metabólica, cânceres e doenças neurodegenerativas [1-3]. Por outro lado, estudos que tenham avaliado os mecanismos envolvidos na influência da RC em modelos animais de HAP são escassos, sendo necessário o aprofundamento acerca da influência dessa sobre os sistemas antioxidantes (tiorredoxina/glutationa). Tais lacunas reforçam a importância da realização do presente projeto visando determinar a influência da restrição calórica sobre os danos pulmonares e cardíacos, além da modulação no estresse oxidativo através da análise dos sistemas glutationa e tiorredoxina em um modelo animal de HAP induzida por monocrotalina.

Para a execução do projeto serão utilizados 72 ratos Wistar machos (60 dias) advindos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas, divididos em 4 grupos:
5. Controle (C): animais com dieta livre;
6. Restrição calórica: animais com restrição calórica;
7. Monocrotalina (MCT): animais com dieta livre e que receberão monocrotalina;
8. Restrição calórica + MCT (RC+MCT): animais com restrição calórica e que receberão monocrotalina.
Os animais serão mantidos em caixas plásticas com medidas de 40 x 34 x 16, totalizando três ou quatro animais por caixa. Todos os animais serão mantidos em ambiente com temperatura controlada (20-23°C), ciclo “claro-escuro” de 12 horas e umidade relativa de 40-60%.
Antes do início do protocolo de restrição calórica, o consumo alimentar dos ratos será mensurado pela diferença entre a ração (padrão do biotério) ofertada e a sobra durante 1 semana de consumo livre. O valor será ajustado pelo número de animais em cada caixa para se obter o consumo individual estimado. Este consumo servirá de referência para a restrição na oferta da ração padrão para os grupos submetidos à restrição calórica, conforme protocolo descrito previamente por Garcia et al. 2019.
Portanto, os grupos 2 e 4 serão submetidos à restrição calórica gradativa: 10% na primeira semana, 20% na segunda semana e 30% da terceira semana até a 12ª. semana, totalizando 10 semanas em restrição calórica de 30%. O consumo alimentar dos grupos controles (mantidos em dieta livre com ração do biotério) continuará sendo aferido semanalmente e servirá de referências para ajustes no percentual de restrição calórica da semana subsequente dos grupos 2 e 4 .
No início da 9ª. semana experimental, os animais serão anestesiados com quetamina e xilazina para análise ecocardiográfica da função cardíaca basal, seguido da indução da hipertensão arterial pulmonar induzida nos grupos 3 e 4 por injeção única de monocrotalina (60mg/kg, i.p.). Com o intuito de minimizar um possível sofrimento dos animais, iremos mensurar o padrão ventilatório, a coloração das mucosas, o peso corporal e a mobilidade na caixa a cada 2 dias. Caso algum animal apresente sinal de sofrimento (taquipnéia, redução do peso corporal maior que 20%, cianose e imobilidade), esse será imediatamente eutanasiado.
Três semanas após a indução da HAP, os animais serão novamente anestesiados com quetamina e xilazina para análise ecocardiográfica da função cardíaca final, seguida da coleta do lavado broncoalveolar e da eutanásia por punção cardíaca. Por fim, será realizada a coleta e preparo dos tecidos para análises.

Ecocardiografia
Essa análise será realizada previamente (basal) e 3 semanas após indução da HAP (final). Para isso, os animais serão anestesiados com quetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por via intraperitoneal e serão posicionados em decúbito lateral para a obtenção das imagens. Será utilizado o sistema EnVisor Philips (Andover, MA, USA) com um transdutor de 12-13 MHz, numa profundidade de 2 cm, e as imagens serão capturadas por um operador treinado com experiência em ecocardiografia animal. Nessa avaliação, serão analisados os seguintes parâmetros: débito cardíaco do ventrículo direito, volume sistólico do ventrículo direito, excursão sistólica do plano do anel da tricúspide (TAPSE), fração de encurtamento do ventrículo direito, mudança de área fraccional do ventrículo direito, índice de performance do miocárdio, a relação entre o tempo de aceleração e o tempo de ejeção do fluxo de sangue pela artéria pulmonar (AT/ET) e a relação entre a velocidade máxima do enchimento rápido e lento do ventrículo direito (E/A). As imagens bidimensionais e os traçados do modo-M serão registrados em CD para posteriores análises.

Lavado Broncoalveolar (BAL)
Logo após a avaliação ecocardiográfica final, os animais receberão mantidos em anestesia profunda para coleta do lavado broncoalveolar conforme descrito por Hoecke et al. 2017 [16]. Para isso, após constatada a perda dos reflexos de dor profunda e o estabelecimento do plano anestésico, os animais serão traqueostomizados. Será infundido 1mL de solução salina gelada (NaCl 0,9%) + EDTA (100uM) pela traqueia do animal e imediatamente coletado por aspiração com a mesma seringa. O procedimento será repetido para coleta de 2 mL de BAL. Para análise das células do lavado broncoalveolar, a contagem total das células será realizada a partir de uma amostra diluída (1:10) em corante azul de trypan. A contagem diferencial será realizada a partir de lâminas citocentrifugadas a 800rpm/10min (CytoproTM-Cytocentrifuge Wescor), coradas com o kit Panótico Rápido e lidas ao microscópio óptico com objetiva de 100x sob imersão. A partir dos dados obtidos serão calculados os valores absolutos e relativos para cada tipo de célula. Em seguida, a traqueia será ocluída e o animal será eutanasiado.

Análises histológicas

O coração e os pulmões de uma parte dos animais serão fixados em formalina tamponada a 10%, processadas em concentrações crescentes de álcool e xilol e parafinizados em Paraplast Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Feito isso, as amostras serão cortadas em seções de 3 μm (pulmão) e 4 μm (VD e VE) de espessura, fixadas em lâminas e coradas com tricômito de masson, hematoxilina e eosina (HE) ou com picrosirius red para análise em microscópio.

Análise de hipertrofia cardíaca

Os corações de uma parte dos animais será dissecado imediatamente após remoção para separar a parede livre do ventrículo direito do septo+ventrículo esquerdo. A análise de hipertrofia cardíaca será feita conforme descrito por Türck et al. (2018) onde o ventrículo direito será pesado e a tíbia da pata traseira direita do animal retirada.

Preparo das amostras para análise do estresse oxidativo

O pulmão e o ventrículo direito serão homogeinizados com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogeneizer, OMNI International, EUA) na presença de 1,15% de KCl (5 ml/g de tecido) e 100 mM de fenilmetil sulfonil fluoreto. Feito isso, as amostras de tecido serão centrifugadas (20 minutos a 10000 x g a 4°C) e o sobrenadante será coletado e armazenado a -80 °C até o início das análises. A quantificação de proteínas será determinada conforme descrito pelo método de Lowry, usando solução de albumina de soro bovino como padrão.

Espécies reativas de oxigênio totais (EROs totais)

As EROs totais serão mensuradas pela oxidação do composto DCFH-DA (diacetato de 2,7-diclorofluoresceína) à DCF (2,7-diclorofluoresceína), conforme protocolo descrito previamente por LEBEL et al. 1992. Os resultados serão expressos como pmol de DCF/mg de proteína.

Sistema da glutationa
A análise do sistema da glutationa será mensurada pela razão entre a glutationa reduzida e a glutationa oxidada (GSH/GSSG) conforme descrito previamente por Akerboom e Sies, 1981. As amostras serão lidas em eptrofotometro (412 nm) e os valores obtidos serão expressos em mmol/grama de tecido.
Sistema da tiorredoxina

A análise do sistema da tiorredoxina será mensurada pela atividade da enzima tiorredoxina redutase e pela expressão gênica e proteica da tiorredoxina-1 (Trx-1) e da vitamina D3-proteína-1 regulada positivamente (VDUP-1) conforme descrito previamente por Zimmer et al. (2021).

Óxido nítrico

Os níveis de óxido nítrico serão mensurados de forma indireta pelos nitritos e nitrados da amostra. Para isso, será realizada a técnica descrita previamente por Granger et al., 1999, usando a reação de Griess e os resultados expressos em mM.


Quantificação da expressão proteica por Western Blot
Amostras de pulmão e coração serão homogeneizadas e preparadas para quantificação da expressão proteica por Western Blot conforme descrito previamente por Laemmli 1970. As membranas serão processadas por imunodetecção usando-se o anticorpo primário Trx-1, VDUP-1, eNOS, iNOS e GAPDH (Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase). Como anticorpos secundários serão utilizados os anticorpos policlonais anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA e Amersham Pharmacia Biotech do Brasil LTDA, São Paulo, SP, Brasil).


Quantificação da expressão gênica
Amostras de pulmão e coração serão imediatamente homogeneizadas em TRIzol (Ambion; Life Technologies, CA, USA) na concentração de 100 mg/mL. Para quantificação do RT-PCR, o RNA das amostras será extraído com Direct-zol RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, CA, USA). Então, será utilizado o kit Máxima First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific) e a expressão do mRNA será mensurada utilizando o reagente Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs). As amostras serão utilizadas para quantificação da expressão da Trx-1, VUDP-1, eNOS, iNOS e B-actina como normalizador.

-GARCIA D.N. et al. Effect of caloric restriction and rapamycin on ovarian aging in mice. Geroscience. 41(4):395-408. 2019.
-ZIMMER, A. et al. Thioredoxin system activation is associated with the progression of experimental pulmonary arterial hypertension. Life Sci., 1;(284):119917, 2021
-COLOMBO, R. et al. Effects of exercise on monocrotaline-induced changes in right heart function and pulmonary artery remodeling in rats. Can J Physiol Pharmacol., 91(1):38-44, 2013
-COLOMBO, R. et al. Exercise training contributes to H2O2/VEGF signaling in the lung of rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Vascul Pharmacol. 87:49-59, 2016.
-TÜRCK, P. et al. Trapidil improves hemodynamic, echocardiographic and redox state parameters of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension model. Biomedicine & Pharmacotherapy, 103: 182–190, 2018.
-LOWRY, O.H. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193;265–275, 1951.
-LEBEL, C.P. et al. Evaluation of the Probe 2′,7′-Dichlorofluorescin as an Indicator of Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress. Chemical Research in Toxicology, 5;(2):227–231, 1992.
-AKERBOOM, T.P.M. & SIES,H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and gl
23. GRANGER, D.L. et al.

A restrição calórica como uma proposta de proteção e prevenção contra danos de diversas doenças através de mecanismos gerais como diminuição do estresse oxidativo, aumento da autofagia, diminuição de marcadores inflamatórios e processos relacionados ao envelhecimento já é estudada há décadas (GUZMAN et al., 2013; KIRCHNER et al., 2012) porém há poucas publicações sobre seus efeitos como proteção frente a HAP.
Tendo em vista que a hipertensão arterial pulmonar é uma doença sem cura e que dispende um investimento financeiro alto para seu tratamento medicamentoso e custas hospitalares, a busca por alternativas que minimizem tudo isso é fundamental. Neste contexto, o manejo alimentar se apresenta como importante via de prevenção/tratamento. Dentre os vários modelos dietéticos, a restrição calórica emerge com grande potencial por minimizar o estresse oxidativo (MATTSON 2005; NOYAN et al., 2015; SPEAKMAN, 2011).
Portanto, com a realização do presente projeto esperamos determinar se a restrição calórica é benéfica em minimizar os danos causados pela hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina e, assim, propor essa intervenção como alternativa não medicamentosa em estudos translacionais que venham a beneficiar os pacientes acometidos por essa doença. Somado a isso, com a realização do presente projeto criaremos uma linha de pesquisa dentro da Universidade Federal de Pelotas em parceria com outros centros de referência no estudo da hipertensão pulmonar. Por fim, serão formados pesquisadores capacitados que virão a contribuir com os avanços da pesquisa no tema.

-DE GUZMAN, J. M. et al. Chronic caloric restriction partially protects against age-related alteration in serum metabolome. Age, v. 35, n. 4, p. 1091, ago. 2013.
-KIRCHNER, H. et al. Caloric restriction chronically impairs metabolic programming in mice. Diabetes, v. 61, n. 11, p. 2734–2742, nov. 2012.
-MATTSON, M. P.; WAN, R. Beneficial effects of intermittent fasting and caloric restriction on the cardiovascular and cerebrovascular systems. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 16, n. 3, p. 129–137, 1 mar. 2005.
-NOYAN, H. et al. Cardioprotective Signature of Short-Term Caloric Restriction. PLOS ONE, v. 10, n. 6, p. e0130658, 22 jun. 2015.
-SPEAKMAN, J. R.; MITCHELL, S. E. Caloric restriction. Molecular aspects of medicine, v. 32, n. 3, p. 159–221, jun. 2011.