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Os queijos são produtos obtidos de massa coagulada de leite, parcialmente dessorada, com ou sem agregação de outras substâncias alimentícias (especiarias, condimentos e aditivos), podendo passar por um processo de maturação ou não (MAPA, 1997). Fonte de proteínas de alta qualidade, lipídios, vitaminas (A, B2 e B12) e minerais (cálcio e fósforo), ao longo dos anos o consumo de queijo aumentou significativamente em todo o mundo. No Brasil segundo a Pesquisa de Orçamento Familiar (2017- 2018) os queijos representam quase 10% dos lácteos consumidos no país. Dentre as variedades de queijos preferidas pelo consumidor e com maior produção destacam-se o queijo mozzarella, queijo Minas, requeijão e queijo prato (COSTA et al., 2018; IBGE, 2020; FEENEY et al., 2021).
Como consequência ao alto consumo, a indústria de queijos evoluiu para um negócio global em que a pesquisa tem um papel importante no aumento da vida útil e na promoção da qualidade e segurança de seus produtos. Uma das principais perdas durante a comercialização de queijos ocorre devido as condições ambientais externas durante seu processamento, armazenamento e manuseio, onde é comum a contaminação por bactérias, bolores e leveduras, podendo ocorrer o desenvolvimento de sabores estranhos, diminuindo a vida útil e a qualidade dos queijos, principalmente quando armazenados sem embalagens adequadas (FAJARDO et al., 2010; COSTA et al., 2018). Além disso, quando manipulado indevidamente, o próprio material da embalagem também pode dar origem a uma contaminação (DOYLE et al., 2015).
Tendo em vista possíveis ameaças de origem alimentar, associadas as implicações sociais e econômicas, surge a demanda por assegurar o fornecimento de alimentos mais seguros por meio do desenvolvimento de novos agentes conservantes não tóxicos com propriedades antimicrobianas e antioxidantes. Com isso, é crescente o interesse pelo uso de conservantes alimentícios naturais, já que aditivos químicos sintéticos, comumente utilizados para o controle de patógenos na indústria de alimentos, oferecem preocupações relacionadas à saúde por parte do consumidor (ALVES-SILVA et al., 2013; PRAKASH et al., 2018; FALLEH et al., 2019).
Dessa maneira, com o objetivo de substituir os conservantes sintéticos, os óleos essenciais (OEs), avaliados como seguros para consumo, começaram a ser considerados alternativas de agentes antimicrobianos naturais. Os mesmos podem ser utilizados para inibir a deterioração de queijos e prolongar o prazo de validade sob a percepção de "estratégia orgânica ou verde", representando uma nova barreira para garantir a diminuição de patógenos de uma matriz alimentar (KHORSHIDIAN, 2018; FALLEH et al., 2020).
Incluído na lista de “Generally Recognized as Safe” (GRAS) para uso como aditivo alimentar pela United States Food and Drug Administration (2022), o óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) é um exemplo de conservante natural que se destaca por sua atividade antimicrobiana e antioxidante (ESCOBAR et al., 2020). Os seus principais compostos, timol e carvacrol, são os principais responsáveis por exercer atividade antimicrobiana por meio de mecanismos, como aumento da permeabilidade celular, alteração dos ácidos graxos da membrana e efeito nas proteínas da membrana (SATO et al., 2007; KHORSHIDIAN, 2018).
No entanto, a concentração do OE aplicado diretamente na matriz de alimentos, como os queijos, deve ser considerada com cautela devido aos seus possíveis impactos negativos nas propriedades sensoriais do alimento (KHORSHIDIAN, 2018). Esse problema pode ser solucionado ao se utilizar abordagens que tornem a liberação e o contato do OE com a matriz alimentícia gradual ou até mesmo indireto. Técnicas como a nanoencapsulação de OEs e/ou a incorporação destes em filmes comestíveis e revestimentos tem como objetivo proteger o alimento frente a contaminação microbiana, mantendo ativa por um longo período de tempo altas concentrações da substância na superfície do alimento (FAJARDO et al., 2010).
Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo desenvolver e avaliar um filme biodegradável à base de amido de batata adicionado de óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) encapsulado em nanofibras de zeína com potencial antimicrobiano para a aplicação em queijos fatiados.

Produção de filmes biodegradáveis de amido de batata
Os filmes de amido de batata serão produzidos pela técnica de casting proposta por Fonseca et al. (2018).

Produção e caracterização das soluções poliméricas formadoras de nanofibras de zeína com óleo essencial de tomilho
As soluções poliméricas serão preparadas utilizando zeína e óleo essencial de tomilho. Para a produção de nanofibras será utilizado 30% de zeína (p/v). Inicialmente, a zeína será dissolvida em solução aquosa de etanol a 70% (v/v, em água ultrapura) sob agitação por 1 h a temperatura ambiente (25 ± 2 °C). Serão utilizadas duas concentrações de óleo essencial de tomilho (v/p, óleo essencial de tomilho/zeína) definidas em testes preliminares. O óleo essencial será adicionado as soluções poliméricas e agitado durante 30 min no escuro a 25 ± 2 °C (BÖHMER-MAAS et al., 2020).
Para a caracterização das soluções poliméricas serão avaliados os parâmetros reológicos e a condutividade elétrica. A avaliação reológica será realizada conforme metodologia descrita por Bruni et al. (2020).
Para a condutividade elétrica, serão necessários 10 mL da solução formadora de nanofibras para posterior análise em um medidor portátil de condutividade (MS TECNOPON, modelo mCA 150P, Brasil). Os resultados serão expressos em μS.cm− 1 (BRUNI et al., 2020).

Produção das membranas de nanofibras
As membranas de nanofibras serão produzidas por meio da técnica de electrospinning de acordo com metodologia adaptada de Böhmer-Maas et al. (2020).
As nanofibras serão produzidas em quantidades suficientes para formar uma membrana bioativa sobre os filmes biodegradáveis. A quantidade será determinada em testes preliminares.
Morfologia e distribuição do tamanho
A morfologia do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será avaliada de acordo com metodologia adaptada de Karim et al. (2021) por microscopia eletrônica de varredura (MEV), utilizando um microscópio eletrônico de varredura (Jeol, JSM-6610LV, EUA).

Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação será realizada nas nanofibras segundo metodologia de Bruni et al. (2020) por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa, para a medição dos principais compostos fenólicos.

Grupos funcionais
Para analisar os grupos funcionais do óleo essencial de tomilho, do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína, será utilizada a técnica de espectrometria infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) equipado com acessório de reflexão atenuada (ATR) (Afinidade IR, Shimadzu, Japão). A resolução espectral será de 4 cm-1 com 120 varreduras e um comprimento de onda entre 4000-5000 cm-1 a temperatura ambiente (KARIM et al., 2021).
Estabilidade térmica
A estabilidade térmica do óleo essencial de tomilho, do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será determinada por análise termogravimétrica pelo uso de um analisador termogravimétrico (TGA, TA-60WS, Shimadzu, Kyoto,Japão), com uma taxa de aquecimento de 10 °C.min−1 em uma faixa de 30–600 °C e fluxo de nitrogênio de 50 mL.min−1.

Ângulo de contato com água
O ângulo de contato com a água (molhabilidade) do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será avaliado de acordo com metodologia utilizada por Bohmer-Maas et al. (2020).

Espessura, cor e solubilidade em água dos filmes
A espessura do filme de amido e do filme de amido com as nanofibras de zeína será determinada usando um micrômetro com precisão de 0,001 mm em oito posições aleatórias ao redor do filme, e os valores médios serão usados nos cálculos de avaliação dos filmes.
A cor dos filmes de amido será determinada com um colorímetro Minolta operando com D65 (luz do dia) e usando os parâmetros de cor CIELab. O parâmetro de cor CIELab (Commission internationale de l'éclairage) será determinado pelos seguintes parâmetros: coordenada L* expressa o grau de luminosidade da cor medida (L* = 100 = branco; L* = 0 = preto), a coordenada a* expressa o grau de variação entre o vermelho (+60) e o verde (-60) e a coordenada b* expressa o grau de variação entre o azul (-60) e o amarelo (+60).
A solubilidade dos filmes será calculada como g.100-1 g de matéria seca do filme solubilizado após imersão por 24 h em água a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C) (GONTARD, DUCHEZ, CUQ, & GUILBERT, 1994).

Propriedades mecânicas dos filmes
As propriedades mecânicas (resistência à tração e percentual de alongamento) dos filmes serão determinadas em texturômetro (TA.TX Plus, Texture Analyzer). Serão avaliadas oito amostras de filme de cada tratamento com 85 mm de comprimento e 25 mm de largura, operando de acordo com o método ATM D 882 - 12 (ASTM, 2012), com separação inicial das garras de 40 mm e velocidade do teste de 0,8 mm.s-1.
A resistência à tração será calculada dividindo-se a força máxima no rompimento do filme, pela área de secção transversal. O modulo de Young é definido como a inclinação da curva de tensão (MPa) pelo alongamento (mm). O percentual de alongamento será determinado dividindo-se a distância final de separação da “probe” pela distância inicial de separação (40 mm), multiplicada por 100 (JANGCHUD; CHINNAN, 1999).

Permeabilidade ao vapor de água dos filmes
A permeabilidade ao vapor de água será determinada pelo método E96 da ASTM (ASTM, 2014) a 25 °C.

Avaliação in vitro do efeito antimicrobiano do filme de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris)
A avaliação do efeito antimicrobiano do filme de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho será realizada pela atividade antimicrobiana em ensaios de micro-atmosfera e disco difusão. Serão testados os efeitos antimicrobianos do composto sobre as cepas padrão das espécies de bactérias Escherichia coli (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832).

Atividade antimicrobiana em micro-atmosfera
A atividade antimicrobiana em micro-atmosfera será avaliada pela técnica proposta por Ghabraie et al. (2016) com pequenas modificações.

Disco difusão
A análise de disco difusão será realizada de acordo com o protocolo proposto pelo Manual Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (2015), com pequenas modificações.
Avaliação in situ do efeito antimicrobiano do filme de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) em queijos fatiados
Queijos fatiados com e sem filmes de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho serão mantidos em temperatura de refrigeração e submetidos a análise microbiológicas de Escherichia coli, Salmonella spp. L. monocytogenes e Staphylococcus coagulase positiva conforme IN n.º 60 (BRASIL, 2019). Considerando que o prazo de validade do queijo fatiado vendido a granel é de 3 dias, serão realizadas análises nos seguintes tempos: 24 h, 72 h e 7 dias.

Enumeração de Escherichia coli e de Estafilococos coagulase positiva
Primeiramente as amostras serão submetidas a diluições seriadas, as análises microbiológicas de E. coli e de Estafilococos coagulase positiva serão realizadas de acordo com as recomendações propostas pela American Public Health Association (APHA) com modificações (DOWNES; ITO, 2001).
Pesquisa de Salmonella spp.
As amostras serão avaliadas pelos métodos descritos pela Instrução Normativa No 62 e pelo anexo D da ISO 6579:2002/Amd 1:2007(E).

Isolamento de L. monocytogenes
Para o isolamento e quantificação de L. monocytogenes será utilizada a metodologia estabelecida pela International Organization for Standardization, ISO 11.290-1 – Detection method, com modificações.

Pesquisa do efeito inibitório da produção de Enterotoxinas estafilocócicas em queijos fatiados com filme de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris)
Queijos fatiados com e sem filmes de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho serão artificialmente contaminados com Staphylococcus aureus portadores de genes para produção de enterotoxinas (A, B, C, D e E) e mantidos em temperatura de refrigeração por 72h. Posteriormente serão submetidos a detecção de enterotoxinas.
Contaminação artificial dos queijos com S. aureus
Serão preparados inóculos segundo a escala de McFarland com 1,5 x 108 UFC/mL de S. aureus e com o auxílio de uma micropipeta serão colocados na superfície das fatias de queijo. Posteriormente, em parte dos queijos contaminados, será colocado o filme de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho e o restante não receberá os filmes. Os queijos serão armazenados em temperatura de < 7 ºC até o período máximo de validade para queijos fatiados armazenados sob refrigeração. Após este período as amostras serão submetidas a análise da presença de enterotoxinas estafilocócicas.

Verificação da presença de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas
O DNA cromossomal será extraído dos isolados de Staphylococcus spp. utilizando kit comercial (PureLink Genomic DNA – K1820-01, Invitrogen®). O DNA extraído dos Staphylococcus spp. serão submetidos à técnica de reação em cadeia da polimerase multiplex (mPCR) a fim de verificar a presença dos genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas A, B, C, D e E.

Detecção de enterotoxinas estaficócicas
Amostras de todos os tratamentos serão submetidas a análise para detecção de enterotoxinas estafilocócicas A, B, C, D e E utilizando o kit comercial VIDAS® Staph enterotoxin II (SET2).

Análise estatística dos resultados microbiológicos
Será aplicada análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Fisher de Mínima Diferença Significativa (LSD test) para verificar se existiam diferenças significativas (p < 0,05) entre os tratamentos utilizados em relação à inibição microbiana. O software utilizado será o programa Statistic 7.1.

Resultados e impactos esperados
Como resultado espera-se obter um filme biodegradável com óleo essencial de tomilho encapsulado, como uma opção natural aos métodos convencionais de conservação, com ação antimicrobiana frente aos microrganismos Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus coagulase positiva e produção de enterotoxinas estafilocócicas. Ainda, utilizá-lo em queijos fatiados como alternativa promissora ecologicamente correta, diminuindo a produção de resíduos gerado pelo uso de plásticos interfolha, e aumentando o tempo de prateleira do produto ao torná-lo um alimento mais seguro ao consumidor.