Nome do Projeto
VIABILIDADE PROBIÓTICA DA KOMAGATAELLA PASTORIS CEPA X-33 LIVRE E MICROENCAPSULADA INCORPORADA EM UMA MATRIZ ALIMENTAR
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
10/04/2023 - 09/04/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
As mudanças dos hábitos alimentares atuais e as influências ambientais vêm promovendo um aumento de reações adversas a alimentos e essas reações variam muito na apresentação clínica, gravidade, fisiopatologia, diagnóstico e tratamento. As reações adversas a alimentos podem ser divididas em duas grandes categorias: imunomediadas (alergias alimentares) e não imunomediadas (intolerâncias alimentares). A ingestão dietética de alimentos que compreendem componentes ativos que regulam os mecanismos de controle das doenças causadas por reações adversas a alimentos como profiláticos ou terapêuticos são normalmente chamados de nutracêuticos ou alimentos funcionais. Os probióticos estão entre os ingredientes alimentares funcionais amplamente estudados e aplicados e quando administrados em quantidades adequadas conferem benefício para a saúde do hospedeiro. A Komagataella pastoris (também chamada de Pichia Pastoris) é uma levedura amplamente conhecida por sua característica de expressar proteínas heterólogas e em alguns estudos tem demonstrado efeitos probióticos promissores. Com isso, nos últimos anos tem ocorrido um interesse crescente no uso de probióticos que oferecem benefícios à saúde e/ou doença, em busca da modulação da microbiota intestinal e manutenção da homeostase do organismo. Dessa forma, o objetivo do estudo será avaliar a viabilidade probiótica da K. Pastoris X33 livre e microencapsulada incorporada em uma matriz alimentar isenta de derivados de leites, ovos e glúten e analisar aspectos físico-químicos, microbiológicos e sensoriais. Pretende-se oferecer ao público que apresenta reações adversas a alimentos praticidade no preparo do alimento e benefícios como digestão eficaz, restrição na quantidade de colonização de patógenos no trato gastrointestinal, modulação do sistema imune, equilíbrio da microbiota intestinal, capacidade elevada de absorção e produção dos minerais e vitaminas, oferecendo uma alimentação saudável.

Objetivo Geral

Avaliar viabilidade probiótica da K. Pastoris X33 livre e microencapsulada incorporada em misturas em pó de bolos isentos de derivados de leites, ovos e glúten e analisar aspectos físico-químicos, microbiológicos e sensoriais.

Justificativa

A viabilidade probiótica da K. Pastoris X-33 e os poucos estudos com sua aplicabilidade em alimentos voltados para o público que apresenta reações adversas, como alergias e/ou intolerâncias, viabilizou a elaboração desse projeto de pesquisa, uma vez que o estudo visa a incorporação da K. Pastoris livre e microencapsulada em um produto de panificação, ou seja, mistura em pó de bolos comercializados voltados para o público alergênico aos derivados de leites, ovos e glúten, onde se pretende explorar esse potencial probiótico e valor funcional da levedura, assim como vida útil prolongada do produto com a K. Pastoris, atrelando ainda o valor nutricional do produto e promovendo qualidade de vida para esse público.
Com isso, pretende-se oferecer ao público mencionado praticidade no preparo do alimento e benefícios como digestão eficaz, restrição na quantidade de colonização de patógenos no trato gastrointestinal, modulação do sistema imune, equilíbrio da microbiota intestinal, capacidade elevada de absorção e produção dos minerais e vitaminas, oferecendo uma alimentação saudável.

Metodologia

A levedura K. Pastoris (Pichia P.) X-33 será cultivada em caldo YPD por 16 a 18h a 28°C, sob agitação de 200 rpm em agitador orbital. Quinhentos mililitros de inóculo serão adicionados a 7L de caldo YPD e incubado em biorreator (Bioflo110, New Brunswick), a 28°C, 500rpm, 1vvm de ar por 24h. Após as células serão centrifugadas a 5000 × g por 15min, lavadas em solução salina 0,9% a 4°C, concentradas dez vezes e quantificadas. Para controle será utilizada a levedura Sacharomyces Boullard adquirida em comércio local.
A microencapsulação será realizada segundo Nunes et al. (2018) com algumas modificações e ambas as soluções serão submetidas ao processo de secagem por spray dryer. O produto final seco será coletado em frascos estéreis e armazenado a -20, 4 e 25°C.
Teste de rompimento da levedura microencapsulada - De acordo Roselen et al. (2019), duas soluções serão usadas para determinar a ruptura da microcápsula: tampão PBS (100mM, pH 7,4) e solução salina 0,5% (m.v−1) pH 2,0 contendo 3mg mL−1 de pepsina.
Eficiência do encapsulamento - A taxa de sobrevivência do microrganismo durante o processo onde pode ser observado a eficiência de encapsulamento (EE) será calculada de acordo com Nunes et al. (2018)
Viabilidade de células sob armazenamento em diferentes temperaturas será realizada segundo Roselen et al. (2019)
Resistência térmica - será avaliada conforme proposto por Pinto, Fritzen-Freire, et al. (2015) e Pinto, Verruck, et al. (2015)
Resistência da K. Pastoris livre e microencapsulada expostas às condições gástricas simuladas e sais biliares
A resistência será avaliada usando a metodologia descrita por Meira, Helfer, Velho, Lopes e Brandelli (2012), com modificações.
Incorporação da K. Pastoris livre e microencapsulada na matriz alimentar mistura em pó do bolo - Serão utilizados três tratamentos com misturas em pó de bolos isentos de derivados de leites, ovos e glúten, os quais serão adquiridas de forma comercial. O primeiro tratamento receberá K. Pastoris livre na concentração de 4% (wv−1), aproximadamente 10log UFCmL−1 de acordo com Pimentel et al. (2015), já o segundo irá receber 1g da K. Pastoris microencapsulada, aproximadamente 12log UFCmL−1 de acordo com Seyedain-Ardabili et al. (2016) e o terceiro servirá de controle.
Após a incorporação, as misturas em pó do bolo serão embaladas individualmente em sacos de polietileno que serão selados em seladora mecânica. Todas as misturas em pó do bolo (inoculadas e controle) serão acondicionadas nas embalagens individuais e armazenadas sob as mesmas condições, em temperatura ambiente (25°C). As misturas em pó do bolo com a levedura livre e microencapsuladas serão submetidas à análise de viabilidade celular nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento em temperatura ambiente.
Viabilidade de K. Pastoris livre e microencapsulada no bolo após assado e expostos às condições gastrointestinais simulado - Durante o tempo de 24h de armazenamento em temperatura ambiente (25°C) após o bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada será analisada a viabilidade da levedura, onde alíquotas de 0,1mL contendo bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada serão diluídas em série e a contagem das leveduras viáveis serão determinadas através do plaqueamento das diluições decimais em ágar YPD após incubação a 28°C por 48h e a concentração de células viáveis será realizada e expressa como unidades formadoras de colônia log por grama (log UFC.g−1).
Ainda, com o tempo de 24h de armazenamento e sob temperatura mencionada acima após o bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada será avaliada a sobrevivência da levedura durante 30, 60 e 120 minutos de exposição a fluidos gástricos e 240 minutos a fluidos intestinais simulados. O teste será realizado conforme Meira, Helfer, Velho, Lopes e Brandelli (2012) com modificações.
Análises físico-químicas e microbiológicas do bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada serão realizadas após 24h do preparo do bolo assado com a K. Pastoris microencapsulada e livre em temperatura de 25°C.
No que se trata das análises físico-química será realizado os seguintes testes: umidade em estufa a 105ºC por 24h, conforme método descrito pela AOAC (1995); lipídios por determinação do teor de gordura conduzido pelo método de Soxhlet (IUPAC, 1979); proteínas pelo método de Kjeldahl, empregando-se o fator 6,25 para a conversão do nitrogênio em proteína bruta (AOAC, 1995); resíduo mineral fixo (RMF) realizado por gravimetria, compreendendo a carbonização da amostra, seguida de incineração em forno mufla a 550ºC (AOAC, 1995); carboidratos estimados por diferença; pH avaliado em triplicata, de acordo com o método da AOAC 945.42 (1995), utilizando um pHmetro digital.
As análises microbiológicas realizadas serão aquelas preconizadas pela Instrução Normativa n° 161 de julho de 2022 (BRASIL, 2022). A mistura em pó para bolo será enquadrada no grupo de alimentos nº 19: CEREAIS, FARINHAS, MASSAS ALIMENTÍCIAS E PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO. Com isso, serão realizadas análises de Bolores e leveduras, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella sp e Estafilococos coagulase positiva.
Análise sensorial - A avaliação sensorial será realizada por julgadores não treinados, após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos no Laboratório de Análise Sensorial da UFPel, utilizando o teste afetivo de aceitação por escala hedônica de 9 pontos, em que 9 = gostei muitíssimo e 1 = desgostei muitíssimo (DUTCOSKY, 2013). Serão oferecidas três amostras de aproximadamente 60g para cada julgador: uma amostra controle (bolo assado sem levedura); uma amostra de bolo assado com levedura livre e uma amostra de bolo assado com levedura encapsulada. Cada amostra será codificada com três algarismos aleatórios e o teste será conduzido sob luz branca, equivalente à luz do dia, em cabines individuas, sem ruídos. As amostras serão apresentadas em temperatura ambiente juntamente com água e biscoito de água e sal, para neutralizar o paladar entre o consumo das amostras. A avaliação será realizada após 60min do término do preparo do bolo assado, em temperatura ambiente (25 °C) e os parâmetros avaliados serão aparência, aroma, textura e sabor. Uma escala estruturada de cinco pontos será utilizada para verificação da intenção de compra, em que 5 = certamente compraria e 1 = certamente não compraria (DUTCOSKY, 2013). O índice de aceitabilidade (IA) dos produtos será calculado pela relação entre a nota média (representada por x) e a nota máxima (representada por y) que o produto recebeu, conforme o cálculo proposto por Teixeira et al. (1987): IA (%) = [(x/y) × 100].
Análise estatísticas dos resultados
Os dados serão submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o programa Graphpad Prism 7 seguido pelo teste de Tukey para comparar médias ao nível de 95% (p < 0,05) de significância. As análises serão realizadas em triplicata, e os resultados da microencapsulação serão calculados com a média de três experimentos independentes.

Indicadores, Metas e Resultados

• Produzir a levedura K. Pastoris X33 em escala laboratorial utilizando cubas de fermentação com capacidade de 4L;
• Produzir a levedura K. Pastoris livre por secagem em estufa;
• Produzir microcápsulas com a K. Pastoris X33 utilizando a técnica de spray dryer
• Avaliar o rompimento da cápsula com a K. Pastoris X33, eficiência do encapsulamento, resistência térmica e viabilidades da levedura livre e encapsulada sob armazenamento em diferentes temperaturas e às condições gastrointestinais simulada;
• Incorporar K. Pastoris livre e microencapsulada na mistura em pó do bolo;
• Analisar a viabilidade celular da K. Pastoris livre e microencapsulada no bolo assado durante passagem ao sistema trato gastrointestinal simulado;
• Analisar aspectos físicos-químicos e microbiológicos do bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada;
• Realizar análise sensorial.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANGELA NUNES MOREIRA3
CANDIDA WOTTER BERGMANN DIAZ2
CAROLINE DE PAULA LOPES CORRÊA5
Ediane Deijaly dos Santos
FABRICIO ROCHEDO CONCEICAO6
FERNANDO DIOGENES TEIXEIRA MEYER
ISABELA BOLDRINI DUTRA RASCH
JOAO VITOR DE SOUZA GERINGER
Ketnen Rieffel das Chagas
PATRÍCIA SILVA DIAZ7
SARAH KALLI SILVA DA SILVA
YASMIM DE MACEDO CORREA

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