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A viabilidade probiótica da K. Pastoris X-33 e os poucos estudos com sua aplicabilidade em alimentos voltados para o público que apresenta reações adversas, como alergias e/ou intolerâncias, viabilizou a elaboração desse projeto de pesquisa, uma vez que o estudo visa a incorporação da K. Pastoris livre e microencapsulada em um produto de panificação, ou seja, mistura em pó de bolos comercializados voltados para o público alergênico aos derivados de leites, ovos e glúten, onde se pretende explorar esse potencial probiótico e valor funcional da levedura, assim como vida útil prolongada do produto com a K. Pastoris, atrelando ainda o valor nutricional do produto e promovendo qualidade de vida para esse público.
Com isso, pretende-se oferecer ao público mencionado praticidade no preparo do alimento e benefícios como digestão eficaz, restrição na quantidade de colonização de patógenos no trato gastrointestinal, modulação do sistema imune, equilíbrio da microbiota intestinal, capacidade elevada de absorção e produção dos minerais e vitaminas, oferecendo uma alimentação saudável.

A levedura K. Pastoris (Pichia P.) X-33 será cultivada em caldo YPD por 16 a 18h a 28°C, sob agitação de 200 rpm em agitador orbital. Quinhentos mililitros de inóculo serão adicionados a 7L de caldo YPD e incubado em biorreator (Bioflo110, New Brunswick), a 28°C, 500rpm, 1vvm de ar por 24h. Após as células serão centrifugadas a 5000 × g por 15min, lavadas em solução salina 0,9% a 4°C, concentradas dez vezes e quantificadas. Para controle será utilizada a levedura Sacharomyces Boullard adquirida em comércio local.
A microencapsulação será realizada segundo Nunes et al. (2018) com algumas modificações e ambas as soluções serão submetidas ao processo de secagem por spray dryer. O produto final seco será coletado em frascos estéreis e armazenado a -20, 4 e 25°C.
Teste de rompimento da levedura microencapsulada - De acordo Roselen et al. (2019), duas soluções serão usadas para determinar a ruptura da microcápsula: tampão PBS (100mM, pH 7,4) e solução salina 0,5% (m.v−1) pH 2,0 contendo 3mg mL−1 de pepsina.
Eficiência do encapsulamento - A taxa de sobrevivência do microrganismo durante o processo onde pode ser observado a eficiência de encapsulamento (EE) será calculada de acordo com Nunes et al. (2018)
Viabilidade de células sob armazenamento em diferentes temperaturas será realizada segundo Roselen et al. (2019)
Resistência térmica - será avaliada conforme proposto por Pinto, Fritzen-Freire, et al. (2015) e Pinto, Verruck, et al. (2015)
Resistência da K. Pastoris livre e microencapsulada expostas às condições gástricas simuladas e sais biliares
A resistência será avaliada usando a metodologia descrita por Meira, Helfer, Velho, Lopes e Brandelli (2012), com modificações.
Incorporação da K. Pastoris livre e microencapsulada na matriz alimentar mistura em pó do bolo - Serão utilizados três tratamentos com misturas em pó de bolos isentos de derivados de leites, ovos e glúten, os quais serão adquiridas de forma comercial. O primeiro tratamento receberá K. Pastoris livre na concentração de 4% (wv−1), aproximadamente 10log UFCmL−1 de acordo com Pimentel et al. (2015), já o segundo irá receber 1g da K. Pastoris microencapsulada, aproximadamente 12log UFCmL−1 de acordo com Seyedain-Ardabili et al. (2016) e o terceiro servirá de controle.
Após a incorporação, as misturas em pó do bolo serão embaladas individualmente em sacos de polietileno que serão selados em seladora mecânica. Todas as misturas em pó do bolo (inoculadas e controle) serão acondicionadas nas embalagens individuais e armazenadas sob as mesmas condições, em temperatura ambiente (25°C). As misturas em pó do bolo com a levedura livre e microencapsuladas serão submetidas à análise de viabilidade celular nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento em temperatura ambiente.
Viabilidade de K. Pastoris livre e microencapsulada no bolo após assado e expostos às condições gastrointestinais simulado - Durante o tempo de 24h de armazenamento em temperatura ambiente (25°C) após o bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada será analisada a viabilidade da levedura, onde alíquotas de 0,1mL contendo bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada serão diluídas em série e a contagem das leveduras viáveis serão determinadas através do plaqueamento das diluições decimais em ágar YPD após incubação a 28°C por 48h e a concentração de células viáveis será realizada e expressa como unidades formadoras de colônia log por grama (log UFC.g−1).
Ainda, com o tempo de 24h de armazenamento e sob temperatura mencionada acima após o bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada será avaliada a sobrevivência da levedura durante 30, 60 e 120 minutos de exposição a fluidos gástricos e 240 minutos a fluidos intestinais simulados. O teste será realizado conforme Meira, Helfer, Velho, Lopes e Brandelli (2012) com modificações.
Análises físico-químicas e microbiológicas do bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada serão realizadas após 24h do preparo do bolo assado com a K. Pastoris microencapsulada e livre em temperatura de 25°C.
No que se trata das análises físico-química será realizado os seguintes testes: umidade em estufa a 105ºC por 24h, conforme método descrito pela AOAC (1995); lipídios por determinação do teor de gordura conduzido pelo método de Soxhlet (IUPAC, 1979); proteínas pelo método de Kjeldahl, empregando-se o fator 6,25 para a conversão do nitrogênio em proteína bruta (AOAC, 1995); resíduo mineral fixo (RMF) realizado por gravimetria, compreendendo a carbonização da amostra, seguida de incineração em forno mufla a 550ºC (AOAC, 1995); carboidratos estimados por diferença; pH avaliado em triplicata, de acordo com o método da AOAC 945.42 (1995), utilizando um pHmetro digital.
As análises microbiológicas realizadas serão aquelas preconizadas pela Instrução Normativa n° 161 de julho de 2022 (BRASIL, 2022). A mistura em pó para bolo será enquadrada no grupo de alimentos nº 19: CEREAIS, FARINHAS, MASSAS ALIMENTÍCIAS E PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO. Com isso, serão realizadas análises de Bolores e leveduras, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella sp e Estafilococos coagulase positiva.
Análise sensorial - A avaliação sensorial será realizada por julgadores não treinados, após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos no Laboratório de Análise Sensorial da UFPel, utilizando o teste afetivo de aceitação por escala hedônica de 9 pontos, em que 9 = gostei muitíssimo e 1 = desgostei muitíssimo (DUTCOSKY, 2013). Serão oferecidas três amostras de aproximadamente 60g para cada julgador: uma amostra controle (bolo assado sem levedura); uma amostra de bolo assado com levedura livre e uma amostra de bolo assado com levedura encapsulada. Cada amostra será codificada com três algarismos aleatórios e o teste será conduzido sob luz branca, equivalente à luz do dia, em cabines individuas, sem ruídos. As amostras serão apresentadas em temperatura ambiente juntamente com água e biscoito de água e sal, para neutralizar o paladar entre o consumo das amostras. A avaliação será realizada após 60min do término do preparo do bolo assado, em temperatura ambiente (25 °C) e os parâmetros avaliados serão aparência, aroma, textura e sabor. Uma escala estruturada de cinco pontos será utilizada para verificação da intenção de compra, em que 5 = certamente compraria e 1 = certamente não compraria (DUTCOSKY, 2013). O índice de aceitabilidade (IA) dos produtos será calculado pela relação entre a nota média (representada por x) e a nota máxima (representada por y) que o produto recebeu, conforme o cálculo proposto por Teixeira et al. (1987): IA (%) = [(x/y) × 100].
Análise estatísticas dos resultados
Os dados serão submetidos à análise de variância (ANOVA) utilizando o programa Graphpad Prism 7 seguido pelo teste de Tukey para comparar médias ao nível de 95% (p < 0,05) de significância. As análises serão realizadas em triplicata, e os resultados da microencapsulação serão calculados com a média de três experimentos independentes.

• Produzir a levedura K. Pastoris X33 em escala laboratorial utilizando cubas de fermentação com capacidade de 4L;
• Produzir a levedura K. Pastoris livre por secagem em estufa;
• Produzir microcápsulas com a K. Pastoris X33 utilizando a técnica de spray dryer
• Avaliar o rompimento da cápsula com a K. Pastoris X33, eficiência do encapsulamento, resistência térmica e viabilidades da levedura livre e encapsulada sob armazenamento em diferentes temperaturas e às condições gastrointestinais simulada;
• Incorporar K. Pastoris livre e microencapsulada na mistura em pó do bolo;
• Analisar a viabilidade celular da K. Pastoris livre e microencapsulada no bolo assado durante passagem ao sistema trato gastrointestinal simulado;
• Analisar aspectos físicos-químicos e microbiológicos do bolo assado com a K. Pastoris livre e microencapsulada;
• Realizar análise sensorial.