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A reserva ovariana consiste principalmente de folículos primordiais contendo o oócito e uma camada de células pré-granulosas. Esses folículos são continuamente recrutados em um processo irreversível, levando à depleção da reserva ovariana e início da menopausa em mulheres [1]. A menopausa resulta em várias mudanças na fisiologia da mulher, incluindo aumento da suscetibilidade a doenças crônicas e redução da expectativa de vida [2-6]. Além disso, reduzir o envelhecimento ovariano é essencial para evitar o declínio da fertilidade observado durante o envelhecimento feminino. A ativação dos folículos primordiais é regulada por uma interação de vários ciclos celulares e vias de crescimento. A ativação do mTORC1 nas células pré-granulosas do folículo primordial aumenta a expressão do KITL, que se liga ao receptor KIT na superfície do oócito. Isso ativa a via PI3K/AKT no oócito, culminando na fosforilação do FOXO3a no núcleo e ativação do folículo primordial [7, 8]. Curiosamente, as vias mTOR e FOXO são amplamente reconhecidas por mediar os efeitos de dietas restritivas na expectativa de vida [9]. O sobrepeso/obesidade associado a um estilo de vida sedentário está associado a maiores taxas de infertilidade e patologias relacionadas à fertilidade entre as mulheres [10]. Por outro lado, as mulheres que buscam estilos de vida saudáveis associam o treinamento de resistência intenso ao consumo de dietas ricas em proteínas e energia. No entanto, os papéis das dietas ricas em proteínas e gorduras no envelhecimento ovariano permanecem obscuros. Além disso, o impacto do exercício é completamente negligenciado nas pesquisas que investigam o envelhecimento ovariano. Poucos estudos indicaram que o exercício aumenta os níveis de AMH em mulheres [11], e não há estudos avaliando a ativação do folículo primordial. Apesar de aumentar a expectativa de vida em camundongos e humanos, o exercício não está associado a aumentos na expectativa de vida máxima, como observado para intervenções dietéticas [12], portanto, seu impacto no envelhecimento ovariano deve ser compreendido.
A estratégia de restrição calórica (CR) geralmente envolve uma redução de 30% na ingestão de alimentos e leva ao aumento da expectativa de vida e à redução da incidência de doenças relacionadas à idade [13]. Os efeitos do CR são parcialmente mediados pela inibição das vias mTOR e FOXO3a [9, 14]. No ovário, 30% CR também reduz a ativação dos folículos primordiais [15, 16]. O efeito da CR no envelhecimento ovariano também é provavelmente mediado pela inibição da atividade da mTOR [17]. No entanto, os efeitos positivos da RC na longevidade foram associados à restrição de proteína (PR). Um estudo avaliando mais de 25 padrões alimentares em camundongos demonstrou que a longevidade e a saúde metabólica são positivamente afetadas por dietas com baixo teor de proteínas e alto teor de carboidratos [18]. Curiosamente, os efeitos de longevidade do PR também podem ser imitados pela restrição de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs) [19]. No ovário, a ativação dos folículos primordiais foi reduzida pela PR e acelerada pelo aumento da ingestão de proteínas [20], que foi associada à modulação do mTOR [20]. Dados preliminares do nosso grupo indicam que a restrição de 67% de proteína ou BCAA reduziu a ativação do folículo primordial, semelhante ao observado para 30% CR, sugerindo um papel central para os BCAAs mediando o efeito de dietas restritivas no envelhecimento ovariano também. O exercício de resistência resulta em diminuição do peso corporal e massa gorda em camundongos alimentados com uma dieta rica em proteínas [21] e camundongos obesos alimentados com uma dieta rica em gordura [22]. No entanto, não se sabe como o exercício neutralizaria os efeitos dessas dietas não saudáveis em relação ao envelhecimento ovariano.
Uma dieta rica em gordura (HFD) leva ao aumento do peso corporal e gordura, bem como resistência à insulina e perda acelerada de folículos primordiais [23, 24]. Notavelmente, reduzir apenas o conteúdo de proteína na HFD causou perda de peso em comparação com a HFD padrão e uma dieta com baixo teor de gordura [25]. No entanto, os mecanismos subjacentes ao efeito da HFD no envelhecimento ovariano permanecem obscuros. No geral, a HFD promove a ativação do mTOR no fígado e no músculo esquelético [26], que é sugerido como o principal mediador dos efeitos deletérios da HFD. Camundongos recebendo uma HFD aumentaram os níveis de BCAA [27], pois as enzimas que oxidam BCAA são reduzidas no tecido adiposo de camundongos obesos e resistentes à insulina [28]. Neste contexto, o papel do exercício torna-se muito importante, uma vez que o exercício aumenta a expressão de α-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada (BCKD) no fígado, coração e músculo esquelético, aumentando o catabolismo de BCAA e reduzindo o conteúdo de BCAA [29]. Isso sugere um aumento da necessidade de BCAA durante o exercício [30], o que poderia mitigar os efeitos de dietas ricas em proteínas e gorduras no envelhecimento ovariano em camundongos exercitados com resistência, de forma semelhante à restrição de BCAA. Consistente com o papel central da inibição de mTOR, uma dieta baixa em BCAA pode reduzir o peso corporal e a deposição de gordura que ocorre em resposta à HFD [31], de forma semelhante ao observado em camundongos sob um regime de exercícios [22]. Os níveis de BCAA também foram aumentados no fluido folicular de mulheres obesas [32], sugerindo ainda mais seu papel no envelhecimento ovariano. No geral, essas evidências sugerem que o papel dos BCAAs é central nos fenótipos associados a dietas restritivas, ricas em gordura e ricas em proteínas. No entanto, faltam evidências para o papel do BCAA na ativação do mTOR nas células da granulosa dos folículos primordiais e no envelhecimento ovariano. Uma melhor compreensão do papel dinâmico dos níveis de BCAA e da ativação do mTOR fornecerá informações para futuros estudos clínicos que avaliam uma dieta saudável e um regime de exercícios que prolongam a vida reprodutiva.

Experimento 1 - A dieta rica em gordura (HFD) aumenta a resistência à oxidação de BCAA, elevando os níveis de BCAA e aumentando a ativação de mTOR nos folículos primordiais. Camundongos fêmeas (n=128) da linhagem C57BL/6 com idade de três meses serão mantidos sob condições controladas. Metade dos camundongos será alimentada com uma dieta rica em gordura (HFD) ou controle com dieta pobre em gordura por três meses (n=64/grupo). Aos seis meses de idade, os camundongos de cada grupo serão divididos em mais quatro grupos: sedentário, exercício resistido, restrição de proteína e restrição de BCAA (n=16/grupo). A proteína será restrita a 7% da energia na dieta, em comparação com 21% no grupo controle, em uma dieta isocalórica [33]. Dietas com restrição de BCAA terão uma redução de 67% de BCAA em dietas isocalóricas e isoproteicas [33]. Os tratamentos durarão três meses. Dados anteriores sugerem um declínio acentuado no número de folículos primordiais entre seis e nove meses de idade em camundongos, portanto, escolhemos esta janela de intervenção [34]. Para o exercício resistido, os camundongos serão submetidos a um exercício de subir escadas cinco dias por semana com cargas adicionadas à base da cauda. O peso da carga aumentará 50% da massa corporal dos camundongos a cada duas semanas, até 200% [35]. Camundongos sedentários serão submetidos ao mesmo manejo sem exercício. Os dados de consumo alimentar serão coletados todos os dias e os dados de peso corporal serão coletados uma vez por semana. Ao final do período, os camundongos serão sincronizados com injeções de eCG e hCG e sacrificados após jejum de 4 horas. Ovários, fígado, músculo e tecido adiposo serão dissecados, pesados e armazenados a -80oC e solução de paraformaldeído 4%.
Experimento 2 - O exercício aumenta a oxidação de BCAA, diminuindo os níveis de BCAA e reduzindo a ativação de mTOR nos folículos primordiais. Camundongos (n = 96) serão mantidos e manuseados conforme descrito para o Experimento 1. A intervenção dietética e de exercícios começará aos seis meses de idade e consistirá em seis grupos da seguinte forma: camundongos treinados com exercícios de resistência recebendo um controle, alta proteína ou dieta rica em BCAA e camundongos sedentários recebendo uma dieta controle, rica em proteína ou rica em BCAA por um período de três meses (n = 16/grupo). A dieta rica em proteínas terá 36% de energia proveniente de proteínas e a dieta rica em BCAA terá o dobro do conteúdo de BCAA [21, 31].
Parâmetros a serem avaliados em ambos os objetivos:
Ciclo estral – duas semanas antes da eutanásia camundongos de cada grupo (n=8) serão submetidos à análise citológica vaginal usando panóptico rápido por 12 dias consecutivos para estimar a duração do ciclo estral.
Metabolismo da glicose – uma semana antes da eutanásia, os camundongos serão submetidos ao teste de tolerância à insulina (n=8/grupo) e teste de tolerância à glicose (n=8/grupo) para medir o impacto da dieta e do exercício no metabolismo da glicose.
Contagem de folículos ovarianos – os ovários serão processados histológicamente, e o número de folículos primordiais, primários, secundários e terciários será contado em cortes seriados de todo o ovário. O diâmetro do folículo e do oócito em cada categoria de folículo será medido.
Hormônios séricos – Plasma 17β-E2 será avaliado por LC/MS/MS conforme descrito anteriormente [36]. Os níveis plasmáticos de FSH e LH serão avaliados por ELISA (FSH: KA2330, Abnova; LH: ABIN6574077, Antibodies-online). Ativação ovariana mTOR/FOXO3a – seções ovarianas serão coradas para mTOR (Cell sig., #2983), p-mTOR (Cell sig., Ser2448, #5536), FOXO3a (Cell sig., #12829) e p-FOXO3a ( Cell sig., #9466) e avaliados sob microscopia confocal para colocalizar a expressão nos folículos primordiais. Além disso, a proteína ovariana será extraída e os lisados serão avaliados por western blot para determinar os níveis de mTOR, p-mTOR, FOXO3a e p-FOXO3a. Níveis e metabolismo de BCAA - A concentração de BCAA será medida usando um kit comercial (Biovision, Milpitas, CA, EUA, #K564-100) em soro, ovário, fígado, músculo e tecido adiposo. O metabolismo de BCAA será avaliado em lisados de tecido total de ovário, fígado, músculo e tecido adiposo por western blot usando os seguintes anticorpos: p-BCKDHA (Abcam, #200577), BCKDHA (Abcam, #126173), PP2Cm (Abcam, # 135286), BCKDK (Abcam, #151297).

Esperamos que o exercício reduza o envelhecimento ovariano através da diminuição dos níveis de BCAA em uma dieta rica em gordura ou proteína. Se nossa hipótese for confirmada, estudos clínicos futuros com nutrição de precisão são necessários para estabelecer o nível de ingestão de proteína/BCAA e carga de exercício para otimizar o metabolismo de BCAA e prevenir o envelhecimento ovariano em mulheres jovens. Essa sintonia fina entre os níveis de ingestão de energia/proteína e a taxa de perda de folículos primordiais será essencial para ajudar mulheres jovens a obter resultados ótimos em um regime de perda de peso, em esportes de alto rendimento ou mesmo em uma vida ativa diária. Acreditamos que este projeto-piloto é o primeiro passo para esse objetivo.