Nome do Projeto
FERMENTAÇÃO ANAERÓBIA DO COLOSTRO BOVINO COMO ALTERNATIVA DE REDUÇÃO DE AFLATOXINAS M1 E B1
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/12/2023 - 27/02/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
As aflatoxinas são compostos químicos que tem efeitos carcinogênicos, teratogênicos, mutagênicos e hepatotóxicos. Além disso, são toxinas amplamente encontradas em alimentos, como leite, derivados lácteos e alimentos para consumo animal e são extremamente estáveis aos métodos de processamento. Os métodos biológicos de descontaminação as aflatoxinas, se utilizam de micro-organismos como as bactérias ácido láticas e tem alcançado resultados promissores. As bactérias ácido láticas podem ser encontradas na silagem de colostro bovino, que é a fermentação anaeróbia do colostro bovino por no mínimo 21 dias. Nesse processo se utiliza as garrafas plásticas como fermentador, é um processo simples, de baixo custo e não necessita de aditivos ou congelamento. O objetivo do trabalho será avaliar a descontaminação ou redução das aflatoxinas M1 e B1 durante o processo fermentativo do colostro bovino e identificar os principais micro-organismos responsáveis pelo processo de redução de aflatoxinas. As amostras de colostro bovino e silagem serão acondicionadas em garrafas plásticas de 500 mL e a silagem fermentada por 21 dias. Ao final da fermentação as amostras serão homogeneizadas e armazenadas a -4 °C. A composição físico-química das amostras será realizada de acordo com o Instituto Adolfo Lutz (2008) para os seguintes parâmetros: acidez, proteína, sólidos totais e cinzas. A análise microbiológica será realizada com adaptações a partir da metodologia descrita por Saalfeld et al., (2013). Um planejamento completo 22 totalizando 11 experimentos será desenvolvido e terá tempo e temperatura como variáveis. A extração das aflatoxinas será realizada de acordo com Sartori et al., (2015) com modificações descritas por Freitas (2020) e a quantificação seguirá o procedimento descrito por Gonçalves et al., (2018) com adaptações já descritas por Freitas (2020). Adaptações poderão ser realizadas para a validação dos métodos de extração e quantificação das micotoxinas. Os resultados serão avaliados por meio da análise de variância, seguido do teste de Tukey com 95% de confiança. A exposição dos animais e humanos a estes compostos tóxicos é um problema de saúde pública que requer atenção, em virtude do alto consumo de leite por crianças e idosos e nos animais essas toxinas também acarretam, principalmente na redução da produção de leite, causando danos ao produtor. A silagem vem como uma alternativa de baixo custo, e é uma técnica amplamente aplicada por produtores de leite, uma vez que propicia maior ganho de peso, garante a transferência de imunidade de maneira adequada e ainda é um alimento pouco explorado, quanto a suas aplicações e benefícios.

Objetivo Geral

O objetivo do presente trabalho será avaliar a descontaminação ou redução das aflatoxinas
M1 e B1 durante o processo fermentativo do colostro bovino e identificar os principais microorganismos responsáveis pelo processo de redução de aflatoxinas.



Objetivos específicos
 Caracterizar físico-química e microbiológica o colostro bovino e a silagem de
colostro bovino;
 Avaliar a redução ou não das aflatoxinas M1 e B1 ao final da fermentação do
colostro;
 Padronizar a metodologia para determinação de aflatoxinas M1 e B1 em colostro
bovino e silagem de colostro bovino;
 Determinar as aflatoxinas M1 e B1 em colostro bovino e silagem de colostro
bovino.

Justificativa

O Brasil tem um papel de destaque no cenário mundial de produção de leite, e esse alimento é utilizado como matéria-prima para uma variedade de derivados lácteos. A segurança micotoxicológica desses alimentos é de extrema importância, pois há um elevado consumo de leite líquido por crianças e idosos e sabe-se que os tratamentos térmicos aplicados na indústria não afetam as aflatoxinas, corroborando para a busca de métodos alternativos. A SCB é um procedimento comum em propriedades leiteiras, e é um produto pouco explorado quanto a suas aplicações em outros processos.
Esse tipo de fermentacao seria capaz de reduzir a contaminacao por micotoxinas quando utilizado combacterias especificas identificadas nesse processo

Metodologia

As amostras de colostro bovino (n = 50) serão adquiridas em propriedades leiteiras localizadas na cidade de Pelotas, no estado do Rio Grande do Sul. As amostras serão acondicionadas em garrafas de plástico (500 mL) e armazenadas sob congelamento até o momento das análises.
As amostras de colostro bovino serão envasadas em garrafas plásticas de 500 mL, armazenadas verticalmente e fermentadas anaerobicamente (após o envase do colostro, a garrafa deve ser apertada até que líquido atingir a superfície onde encaixa a tampa) a temperatura ambiente por no mínimo 21 dias. Após o tempo de fermentação, as amostras serão homogeneizadas em blender durante 30 s, colocadas em recipientes plásticos estéreis de 80 mL e armazenadas congeladas até o momento das análises.

Os parâmetros físico-químicos do colostro e silagem de colostro que serão determinados: acidez (n.° 427/IV), proteína (n.° 037/IV), sólidos totais (n.° 429/IV) e cinzas (n.°437/IV), utilizando os métodos do Instituto Adolfo Lutz (2008).
A análise microbiológica será desenvolvida de acordo com o método proposto por Saalfeld et al. (2013) com adaptações. As amostras de silagem e colostro bovino serão semeadas nos meios de cultivo: ágar Chapman, ágar MacConkey, ágar Brain Heart Infusion e ágar seletivo para Lactobacillus. Em seguida, as placas serão incubadas a 37 °C durante 72 h em aerobiose. A identificação dos micro-organismos será através da técnica de coloração de Gram e provas bioquímicas (BARROW; FELTHAM, 1993).

O planejamento experimental será desenvolvido com o colostro bovino fortificado com os padrões de aflatoxinas M1 e B1, previamente ao início da fermentação e, para cada ensaio, haverá a amostra controle de colostro in natura sem contaminação. As variáveis avaliadas no planejamento serão: tempo (V1) e temperatura de fermentação (V2) (n = 2), que serão analisadas aos 21, 71, 193, 315 e 365 dias e 15,0; 17,9; 25,0; 32,1 e 35,0 °C, respectivamente. Além disso, o planejamento contará com três pontos centrais (PC) e 4 axiais, totalizando 11 experimentos, como mostra a Tabela 1. Cabe destacar que esses ensaios serão contaminados com os padrões de aflatoxinas em concentrações a definir.

A extração de aflatoxina M1 e B1 em amostras de silagem de colostro bovino e colostro bovino será realizada em triplicata, utilizando o método de QuEChERS (SARTORI et al., 2015) com adaptações de Freitas (2020). Primeiramente, será realizado o preparo da amostra, para isso 30 mL de amostra será colocada em tubo falcon de 50 mL para posterior centrifugação (3000 x g, 5 min, 4 °C) e remoção manual da gordura, este procedimento deve ser realizado três vezes. Logo após, 5 mL da amostra sem gordura deverá ser transferida para um novo tubo e será adicionado 10 mL de hexano, 15 mL de acetonitrila acidificada (1% de ácido acético (v/v)) e o sistema será agitado manualmente durante 1 min. Em seguida, 6 g de sulfato de magnésio e 1,5 g de cloreto de sódio previamente secos serão adicionados e os tubos contendo essa mistura serão submetidos a agitação em vórtex pelo período de 1 min e 30 s e por fim, serão centrifugados novamente (2330 x g, 7 min, 4 °C).
Após o processo de centrifugação, o hexano será removido e 5 mL da fase que contenha a acetonitrila será retirada, recolhida em frasco âmbar e seca a 60 °C em banho-maria. As amostras serão mantidas a -4 °C até o momento da quantificação. É importante salientar que caso seja necessário serão feitas adaptações em decorrência das diferenças da matriz original.
A quantificação das micotoxinas será realizada de acordo com Gonçalves et al. (2018), com adaptações descritas por Freitas (2020). A partir do extrato seco, os mesmos serão ressuspensos em fase móvel composta por acetonitrila: metanol: água ultrapura (24:16:60, v/v). Os compostos serão identificados utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a um detector de fluorescência com derivatizador fotoquímico pós-coluna, coluna Kromasil C18 (5 µm, 15 cm x 4,6 mm) com vazão de fase móvel de 1 mL min-1, temperatura de forno de 40 °C e processamento no software LC Solution. Os comprimentos de onda de emissão e excitação serão 370 e 410 nm, respectivamente, o volume de injeção da amostra será de 20 µL e o tempo de corrida cromatográfica será de aproximadamente 12 min. Este método será validado através do estudo dos seguintes parâmetros: seletividade, limite de detecção, limite de quantificação, curva de calibração, precisão, exatidão e robustez.

Os resultados serão avaliados através da análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey, com 95% de confiança com o uso do software Statistica 10.

Indicadores, Metas e Resultados

Ao final dos experimentos espera-se que a fermentação do CB proporcione a
descontaminação ou redução das aflatoxinas M1 e B1 e a partir da identificação dos microorganismos responsaveis pela diminuição dos níveis das toxinas pretende-se propor um método
de detoxificação que possa ser aplicado em CB, SCB, leite e derivados lácteos, buscando atingir
os níveis de AFLA preconizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
As contribuições científicas deste trabalho serão por publicações em periódicos, participação e apresentação de trabalhos em simpósios e congressos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAMILA DOS SANTOS CARDOZO
GINIANI CARLA DORS4
HELENICE GONZALEZ DE LIMA2
PATRICIA DA SILVA NASCENTE2
PEDRO RASSIER DOS SANTOS
ROSANA BASSO KRAUS
SILVIA REGINA LEAL LADEIRA2

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