Nome do Projeto
Desenvolvimento de testes sorológicos nacionais (Point-of-Care e ELISA) para COVID-19
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
08/07/2020 - 02/06/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
A pandemia de COVID-19 causada pelo coronavírus SARS-CoV-2 é a maior crise que a humanidade está enfrentando desde a gripe espanhola em 1918. Pelo menos 80% dos infectados têm pouquíssimos sintomas ou nem sequer os apresentam (assintomáticos) e, mesmo assim, transmitem o vírus. Assim, medidas de controle precisam ser urgentemente implementadas, além do isolamento social e cuidados de higiene, como o desenvolvimento de testes rápidos para o diagnóstico da doença, considerado uma das principais limitações no combate à pandemia e a primeira de oito prioridades de pesquisa identificadas por um grupo de especialistas da OMS. Testes sorológicos importados são validados com amostras biológicas de outros países, não levando em conta aspectos genéticos, socioeconômicos e ambientais do Brasil, o que pode afetar diretamente o desempenho (sensibilidade e especificidade) dos mesmos e a qualidade dos estudos epidemiológicos desenvolvidos. O objetivo da proposta é desenvolver testes sorológicos do tipo ELISA e Point-of-Care para detecção e quantificação de IgM, IgA e IgG anti-SARS-CoV-2. Cabe fortemente destacar que o desenvolvimento de testes para identificar o perfil sorológico da população em contato com o vírus ao longo da pandemia promove segurança aos gestores de saúde pública para tomada de decisão junto ao enfrentamento da crise e fortalece a soberania nacional, reduzindo a dependência de produtos biotecnológicos estratégicos importados.

Objetivo Geral

Desenvolver testes sorológicos do tipo ELISA e POC (imunocromatografia de fluxo lateral) para detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2, para uso como ferramenta auxiliar de diagnóstico e estudos epidemiológicos da COVID-19.

Justificativa

Dentre os testes sorológicos usados rotineiramente no diagnóstico de doenças infectocontagiosas, dois merecem destaque: i- ELISA, um ensaio imunoenzimático que apresenta tempo médio de execução de 3 h, elevada eficiência (sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade), possibilidade de automação, disponibilidade de reagentes quimicamente estáveis, facilidade de implemetação nos laboratórios clínicos de hospitais, capacidade de gerar resultados quantitativos (título de anticorpos) e de analisar simultaneamente um grande número de amostras e; ii- ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral, um teste remoto do tipo POC, do inglês Point-of-Care, que significa teste realizado próximo ao paciente, o qual destina-se a dar uma resposta rápida que possa levar à confirmação da doença ou a uma possível mudança no tratamento, apresenta operação rápida e simples, com obtenção de resultados imediatos (cerca de 15 min), baixo custo e o não requerimento de técnicos qualificados ou equipamentos sofisticados e de alto custo (Xiao et al., 2020).
Um ELISA indireto para detecção de IgM e IgG, usando a proteína do nucleocapsídeo (N) do SARS-CoV Rp3 como antígeno (92% de identidade com a N do SARS-CoV-2), foi utilizado para avaliar a dinâmica de anticorpos anti-SARS-CoV-2 (Zhou et al., 2020). Além de boa sensibilidade, o teste não apresentou reatividade cruzada com outros coronavírus humanos (Zhang et al., 2020). Outro estudo que usou ELISA indireto para detecção de anticorpos IgM, IgA e IgG anti-SARS-CoV-2, utilizando a proteína N recombinante como antígeno, mostrou que a detecção de anticorpos IgM e IgA ocorreu 5 dias (IQR 3-6) após o início dos sintomas, enquanto que de IgG, 14 dias (IQR 10-18). Esse teste apresentou sensibilidade de 85,4%, 92,7% e 77,9% para detecção de IgM, IgA e IgG, respectivamente, sendo a taxa positiva de anticorpos IgM de 93,1% em casos prováveis, ou seja, pacientes com qRT-PCR negativo mas com manifestações típicas (Guo et al., 2020).
Testes sorológicos do tipo POC também têm sido desenvolvidos para detecção simultânea de anticorpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2. O ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral desenvolvido por Li et al. (2020) apresentou sensibilidade de 88,7% e especificidade de 90,6%, sendo avaliado com 397 amostras de sangue de pacientes confirmados por qRT-PCR e 128 amostras de pacientes negativos. Entretanto, a possibilidade de reatividade cruzada com outros vírus, principalmente aqueles responsáveis por infecções respiratórios, como o vírus influenza, sincicial respiratório (VSR) e outros coronavírus humanos (resfriado), não foi estudada, bem como o desempenho do teste com diferentes níveis de anticorpos (estágios da infecção). A Pharmact (Alemanha) desenvolveu um imunoensaio de 20 minutos para detectar anticorpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 utilizando os antígenos N e os domínios S1 e S2 da proteína S, alvos também contemplados na presente proposta. O teste foi validado utilizando amostras de 114 pacientes infectados e 126 controles, apresentando 100% de especificidade. Quanto a sensibilidade, o teste apresentou 70% na detecção de IgM no estágio inicial da infecção (dias 4 a 10) e 92,3% entre os dias 11 e 24, enquanto que para IgG, apresentou 98,6% entre os dias 11 e 24, com sensibilidade geral de 87% (Sheridan, 2020). Embora a nucleoproteína e spike possam servir como antígenos sensíveis (Vashist, 2020), outros antígenos e epítopos específicos devem ser explorados para uso em testes sorológicos (Xiao et al., 2020), aspecto que será abordado na presente proposta.
Atualmente no Brasil, não existem testes sorológicos para COVID-19 com tecnologia nacional e, então, todos os testes precisam ser importados, o que gera maiores gastos, demora na distribuição para centros de saúde e, consequentemente, divulgação tardia dos resultados. Neste contexto, o desenvolvimento de testes sorológicos nacionais para o diagnóstico da COVID-19 (ELISA indireto e POC), mais adequados e acessíveis para uso no Brasil, é estratégico no combate à pandemia. Testes sorológicos importados são validados com amostras biológicas de outros países, não levando em conta aspectos genéticos, socioeconômicos e ambientais do Brasil, o que pode afetar diretamente o desempenho (sensibilidade e especificidade) dos mesmos e a qualidade dos estudos epidemiológicos desenvolvidos. Alguns destes testes foram aprovados de forma urgente devido à pandemia (Loeffelholz and Tang, 2020), levantando dúvidas se foram validados adequadamente. Recentes reportagens no Reino Unido, Espanha, República Tcheca e Holanda reforçam esta preocupação, alertando a comunidade científica sobre o desempenho ruim de alguns testes sorológicos comercializados (Bell, 2020; Sevillano and Alfageme, 2020; Vashist, 2020). Por fim, cabe fortemente destacar que o desenvolvimento de testes de diagnóstico para identificar o perfil sorológico da população em contato com o vírus ao longo da pandemia, promove segurança aos gestores de saúde pública para tomada de decisão junto ao enfrentamento da crise e fortalece a soberania nacional, reduzindo a dependência de produtos biotecnológicos estratégicos importados.

Metodologia

Metodologia a ser empregada: o detalhamento da metodologia utilizada está no Anexo.
Criação de um banco de amostras bem caracterizadas (300 a 500). Em Pelotas, a coleta de dados e de amostras será realizada no Hospital Escola (HE) da UFPel, no Hospital Universitário São Francisco de Paula (HUSFP) da UCPel e nas UBS localizadas em diferentes bairros do município de Pelotas sob a responsabilidade da UFPel (HE) e UCPel (HSFP), onde haverá vigilância para COVID-19. Em Porto Alegre, as coletas ocorrerão no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) e na Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre (ISCMPA). Os critérios de inclusão serão: I- o indivíduo apresentar diagnóstico clínico de suspeita de COVID-19, emitido pelas instituições públicas de saúde envolvidas e; II- concordar com a sua participação no estudo assinando o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Amostras de sangue serão coletadas intermitentemente a cada 2 dias para obtenção dos soros, os quais serão inativados a 56 oC por 30 mim e congelados. Amostras de soros de pacientes com COVID-19 residentes em Manaus-AM, coletadas durante estudo clínico coordenado pelo infectologista Dr. Marcus Lacerda da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), estão disponíveis para o estudo. Amostras de soros positivos para COVID-19 de Aracaju-SE serão gentilmente cedidas pelo Dr. Lysandro Borges da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Para confirmação de pacientes suspeitos de COVID-19 ou diagnosticados por teste rápido, será utilizada a técnica de qRT-PCR indicada pela Fiocruz, Ministério da Saúde (MS).
Seleção dos antígenos de SARS-CoV-2: Uma criteriosa revisão de artigos científicos (ANEXO - Tabela 1), patentes (ANEXO - Tabela 2) e análises de bioinformática-imunoinformática (ANEXO - Figura 2) foram realizadas para nortear a escolha dos antígenos (ANEXO - Tabela 3). A descrição detalhada da análise de bioinformática-imunoinformática realizada está no Anexo.
Produção dos antígenos (antígenos recombinantes). Genes sintéticos otimizados para 10 antígenos foram encomendados (Epoch Life Science, Missouri, USA) e devem chegar ao Brasil no final de abril. A descrição detalhada da expressão e purificação dos antígenos recombinantes está no Anexo.
Seleção dos antígenos recombinantes mais sororreativos (antigenicidade) para serem usados no desenvolvimento dos protótipos. As principais etapas do imunoensaio de impressão com antígenos múltiplos (MAPIA) são mostradas na Figura 3 (ANEXO) e inclui imobilização de antígenos em membranas de nitrocelulose, incubação de tiras com amostras de soro e detecção de anticorpos à base de imunoenzimas (Lyashchenko et al., 2000). A triagem dos antígenos será realizada em duas fases nas avaliações com as amostras de soro. Os operadores ficarão cegos para a identidade da amostra. No estágio 1, as tiras MAPIA contendo os 10 antígenos em diferentes concentrações e em linhas separadas serão rastreadas para determinar a reatividade com IgM, IgG e IgA em amostras de soro de 30 casos COVID-19 confirmados em laboratório (15 de fase aguda e 15 de fase convalescente) e soros de 30 indivíduos saudáveis do controle comunitário do Brasil. Essa seleção de amostra garantirá que se tenha um número adequado para determinar o desempenho de cada antígeno na detecção de indivíduos que foram submetidos à soroconversão após infecção por SARS-CoV-2. Na fase 2, serão determinadas as combinações de antígenos que podem melhorar o desempenho no MAPIA. Os antígenos identificados na fase 1 serão aplicados individualmente ou em combinações.
Desenvolvimento do teste do tipo ELISA para COVID-19. Fase 1 - a triagem inicial desses antígenos será realizada com até 10 amostras positivas de soro de pacientes com COVID-19 e 20 amostras negativas de indivíduos saudáveis. Serão avaliados antígenos individuais e em combinação (coquetel). As concentrações/diluições ideais do antígeno adsorvido na placa, soro, conjugado enzima-anticorpo e solução do substrato serão determinadas por titulações de checkerboard de cada reagente contra todos os outros reagentes após a confirmação da melhor escolha de microplacas de reação. Experimentos adicionais serão realizados para determinar as variáveis físicas, químicas e temporais ideais ao protocolo, incluindo temperaturas e tempos de incubação; o tipo, pH e molaridade de tampões de diluente, lavagem e bloqueio; e equipamento usado em cada etapa do ensaio (por exemplo, pipetas e arruelas que proporcionam a melhor reprodutibilidade). Serão avaliados diferentes formatos de ELISA, representados na Figura 4. Fase 2 - a avaliação do desempenho dos protótipos de ELISA e teste POC será realizada testando um painel de 250 amostras positivas e 250 amostras controle [indivíduos saudáveis (n = 150); influenza (n = 10), resfriado (n = 10), vírus sincicial (n = 10), HIV (n = 10), zika (n = 10) e dengue (10)]. Isso possibilitará calcular a sensibilidade e especificidade diagnóstica dos protótipos. O ponto de corte para a determinação da sensibilidade e especificidade será calculado usando a análise ROC (Crowther, 2000).
Desenvolvimento do teste do tipo POC para detecção de IgM e IgG anti-SARS-CoV-2. Os seguintes testes imunocromatográficos são propostos: protótipo IgM/IgG, protótipo IgM e protótipo IgG. Os três protótipos serão montados como cards compostos pela almofada da amostra, a zona do conjugado (fibra de vidro), a membrana de nitrocelulose (NC) e a almofada absorvente. A NC será adsorvida com antígenos recombinantes de SARS-CoV-2 na linha Teste (T) e com proteína A na linha Controle (C). A zona do conjugado conterá anticorpos anti-IgM e anti-IgG humanas conjugados a AuNP (ouro coloidal) no protótipo IgM/IgG (Figura 5 - ANEXO), anticorpo anti-IgM humana conjugado a AuNP no protótipo IgM (Figura 6 - ANEXO) e anticorpo anti-IgG humana conjugada a AuNP no protótipo IgG (Figura 7 - ANEXO). A preparação das AuNPs e a conjugação dos anticorpos será realizada conforme descrito na literatura científica (Gussenhoven et al., 1997; Snowden & Hommel, 1991). O XYZ Airjet Dispenser System da BioDot Inc (Irvine, CA, EUA) será utilizado para impregnar os conjugados com AuNP na fibra de vidro e para adsorver os antígenos e proteína A na NC. Finalmente, os cards montados serão cortados em fitas de 4 mm de largura utilizando CM4000 BioDot Paper Cutter (Irvine, CA, USA) e estocados a 4oC.

Indicadores, Metas e Resultados

Montagem da coleção de amostras (em andamento); seleção de antígenos de SARS-Cov-2 (já concluída); design e encomenda de genes sintéticos (já concluída); triagem dos melhores antígenos; desenvolvimento e validação do ELISA; desenvolvimento e validação do POC.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ALAN JOHN ALEXANDER MCBRIDE8
ANGELA NUNES MOREIRA1
CLÓVIS MOREIRA JR.
ELIZA ROSSI KOMNINOU
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
FABRICIO ROCHEDO CONCEICAO8
FRANCISCO DENIS SOUZA SANTOS
FREDERICO SCHMITT KREMER
GEFERSON FISCHER1
LIANA NUNES BARBOSA
LUCIANO DA SILVA PINTO2
MARIANA HÄRTER REMIÃO
MARILIANA LUIZA FERREIRA ALVES
MIGUEL ANDRADE BILHALVA
Matheus B. T. Fogaça
MÁRCOS ROBERTO ALVES FERREIRA
NATASHA RODRIGUES DE OLIVEIRA
ODIR ANTONIO DELLAGOSTIN
RAFAEL AMARAL DONASSOLO
RAFAEL RODRIGUES RODRIGUES
Samira Bührer
THAIS LARRÉ OLIVEIRA
VANESSA GALLI

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
FAPERGS / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado Rio Grande do SulR$ 320.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
Material de laboratórioR$ 150.000,00
Equipamentos e material permanente (móveis, máquinas, livros, aparelhos etc.)R$ 170.000,00

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