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O consumo de carne bovina, suína e de frango está em constante crescimento. Uma projeção realizada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), no ano de 2017, aponta maiores taxas de crescimento da produção no período até 2028. Segundo o estudo, a carne suína e a carne de frango aumentarão em 2,6% ao ano e a carne bovina tem um crescimento projetado de 1,9% ao ano. A projeção para o final da próxima década é produzir 34,2 milhões de toneladas de carne de frango, bovina e suína (MAPA, 2018).
A carne in natura, devido a sua composição química, juntamente com fatores intrínsecos como atividade de água e pH, se torna um meio propício para o crescimento e multiplicação de diferentes tipos de microrganismos (ORDONHEZ, 2005). Estes são classificados em dois grupos, os deteriorantes e os patogênicos. Os deteriorantes são causadores de alterações químicas, físicas e sensoriais, sendo prejudicais ao aspecto do alimento, como por exemplo, modificação de cor, do odor, da textura e do sabor (MORAES, 2010). Os principais microrganismos envolvidos na deterioração de alimentos são Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Shewanella putrefaciens, Brochotrix thermosphacta, Lactobacillus, algumas espécies da Família Enterobacteriaceae, e ainda as leveduras e os bolores (ALCANTRA et al., 2012). O grupo de microrganismos patogênicos também pode estar presente na carne in natura, responsável pelas doenças transmitidas por alimentos (DTA). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) as DTA são aquelas de natureza infecciosa ou tóxica, causadas pela ingestão de alimentos ou água contaminados por agentes biológicos, químicos e físicos, representando um grave risco à saúde.
Segundo Melo et al. (2018), DTA representam um importante problema de saúde pública, por acometerem milhões de pessoas em todo o mundo. Tratando-se de carne, as principais bactérias patogênicas encontradas são: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp., Yersinia enterocolítica e Clostridium perfringens (ESTEVES, 2006). Perante o cenário apresentado, visa-se o aumento da vida útil e a comercialização de alimentos seguros, a partir do uso de aditivos químicos para conservação de produtos alimentícios. A Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, conforme a Portaria nº 540 de 27 de outubro de 1997, define aditivos químicos como substâncias que quando incorporadas ao alimento, irão manter ou melhorar as propriedades químicas, físicas, sensoriais e nutricionais, bem como inibir o desenvolvimento e multiplicação microbiana. Diferentes tipos de aditivos alimentares são permitidos pela legislação brasileira para a fabricação de diversos produtos de origem animal, entretanto, se observa que muitos podem ser a causa de problemas de saúde, relacionados ao seu uso, sendo muitos associados a alergias e até mesmo ao desenvolvimento de células cancerígenas (POLÔNIO e PERES, 2009).
Dessa forma, existe uma preocupação muito grande, principalmente por parte do consumidor, por alimentos não contenham aditivos químicos em sua composição. Neste contexto, o uso de óleos essenciais derivados de plantas aromáticas torna-se alternativa viável e natural em substituição a estes aditivos. Por serem formados por diferentes compostos químicos, os óleos essenciais, em grande maioria, apresentam alta bioatividade, como por exemplo, a capacidade de inibir microrganismos, além de apresentarem atividade antioxidante, antifúngica e anti-inflamatória (PEREIRA, 2006; SILVA et al., 2019).
Nos últimos anos, é gradativo o número de pesquisas realizadas com o intuito de obterem-se novos métodos para conversação de alimentos. Estudos sobre a atividade antimicrobiana de óleos essenciais frente à patógenos de origem clínica e alimentar têm sido realizados, principalmente in vitro (SANTOS et al., 2017). É válido ressaltar que o uso de óleos essenciais com efeito antimicrobiano em contato direto com o alimento apresenta limitações, havendo pesquisas que demonstram o impacto negativo nas características sensoriais do produto alimentício (MENDONÇA, 2018), porém existem possibilidades para que estes óleos essenciais desenvolvam a função de conservação, sem contato direto com o alimento. Exemplo disto é o estudo que Oliveira (2017) realizou com cobertura de quitosana contendo óleo essencial de Sálvia (Salvia officinalis L.) em morangos, com o propósito de amenizar interferências sensoriais. Fonseca et al. (2020) também realizaram um estudo, onde avaliaram a atividade antioxidante de extrato da casca de pinhão encapsulado em fibras de amido e os resultados indicaram que o material apresentou potencial antioxidante. Outra pesquisa realizada em 2017 por Rutz et al. destacou a eficiência do óleo de palma contendo alto teor de carotenóides, encapsulado com quitosana e xantana, apontando um perfil de liberação satisfatório de carotenóides.
No que tange a encapsulação desses óleos essenciais em matrizes com escala nanométrica, como nanofibras, esta é promissora devido a sua alta área superficial em relação ao volume e possibilidade de uma liberação controlada e específica doscompostos dos óleos essenciais. A nanotecnologia apresenta uma área de pesquisa muito ampla, com grande potencial para implementação de inovações na indústria de alimentos, desde a produção até o processamento, armazenamento e desenvolvimento de novos produtos para fins específicos (LA ROCHA, 2014). A nanotecnologia é uma tendência atual na ciência do século XXI que pode ser aplicada em diversas áreas indústria de alimentos, permitindo o desenvolvimento de novos materiais para produção de embalagens, além de ser um método que melhora a segurança alimentar (GOMES et al., 2015). As nanofibras de celulose, também têm sido utilizadas para aprimorar o desempenho e propriedades de embalagens (ASSIS et al., 2012).
Em um trabalho de Kuntzler (2017) foi realizada a produção de nanofibras poliméricas incorporadas com compostos fenólicos obtidos da microalga Spirulina com potencial propriedade antimicrobiana. Outros estudos foram encontrados relatando a encapsulação de óleos essenciais. Radunz (2017) encapsulou óleo essencial de cravo-da-índia com o objetivo de testar a atividade bactericida em diferentes tipos de microrganismos patogênicos. O óleo essencial encapsulado apresentou forte atividade antimicrobiana com potencial para controle microbiológico. Entretanto, são poucos os estudos focados na produção de um nanomaterial com atividade antimicrobiana aplicado à conservação de cortes cárneos.
Levando em consideração a escassez de pesquisas sobre o assunto, este estudo visa o desenvolvido de um sachê de nanofibras de zeína incorporados de óleo essencial de tomilho buscando verificar se o mesmo é capaz de inibir in vitro o desenvolvimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli e inibir in situ, em cortes cárneos acondicionados em bandejas de poliestireno, microrganismos mesófilos aeróbios, Escherichia coli e Salmonella spp.

Material e métodos

Considerando o momento de isolamento social e de pandemia, todas as atividades serão realizadas isoladamente por um membro da equipe ou a distância, de maneira virtual, on line, utilizando meios digitais e os contatos entre os membros da equipe do projeto e público alvo serão realizados por e-mail, WhatsApp ou telefone até que se tenha segurança para contatos pessoais.

Produção das soluções poliméricas formadoras de nanofibras de zeína com óleo essencial de tomilho
As soluções poliméricas serão preparadas usando zeína em duas concentrações diferentes. Para o processo de nanofibras será utilizado 10% peso/volume de zeína. Incialmente, a zeína será dissolvida em solução aquosa de etanol a 70% sob agitação. Será definido em testes preliminares as concentrações de óleo essencial de tomilho (p/p, óleo essencial de tomilho OEA/zeína), o qual será adicionado às soluções de polímero e agitado durante 15 min no escuro a 25 ± 2°C.Para a avaliação reológica das soluções poliméricas será utilizada a metodologia descrita por Fonseca (2020). Uma amostra de aproximadamente 0,5 mL das soluções formadoras de fibras, serão colocadas em um recipiente de aço inoxidável, o qual será acoplado a um reomêtro programável (BrookfieldRS-CPS + Rheometer, EUA). A análise será realizada usando um fuso C50-1 (cone 50 mm) e taxa de cisalhamento. Os dados serão analisados em software Rheo 3000 v1 2. Para condutividade elétrica, serão necessários 10 mL da solução formadora de fibras para posterior análise em um medidor portátil de condutividade (MS TECNOPON, modelo mCA 150P, Brasil). Os resultados serão expressos em μS.cm− 1. As soluções poliméricas serão submetidas ao processo de electrospinning para a produção das nanofibras.

Produção das nanofibras
Por meioda técnica de electrospinning ou eletrofiação serão produzidas as nanofibras. Adaptado de Fonseca (2016) após o preparo das soluções poliméricas formadoras de fibras, a amostra será injetada em uma seringa plástica com concentração a ser definida, acoplada diretamente em uma agulha metálica. A solução será bombeada com uma fonte de alta tensão (5 – 50 kV) e baixa corrente (0,5 – 1 μA). Os parâmetros de processamento como taxa de fluxo de alimentação, distância do alvo, concentração da solução polimérica e voltagem serão pré-definidos em testes preliminares, onde serão variados de maneira aleatória, sendo fixados após a obtenção de nanofibras uniformes e contínuas.

Caracterização das nanofibras de zeína com óleo essencial de tomilho
A morfologia das nanofibras de zeínaserá avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MET), utilizando um microscópio eletrônico de varredura (Jeol, JSM-6610LV, EUA). As amostras serão colocadas em um suporte de aço inoxidável (“stub”), revestido por pulverização catódica (pulverização catódica, DentonVacuum, Desk V, EUA). A análise será realizada com uma aceleração da tensão de 10 kV.
A distribuição do tamanho e o diâmetro médio das nanofibras de zeína serão medidas por meio de micrografias das fibras que serão selecionadas aleatoriamente, utilizando o software ImageJ (versão 2015, EUA).
Para analisar a composição química das nanofibras de zeína será utilizada a espectrometria infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) em equipado com acessório de reflexão atenuada (ATR) (Afinidade IR, Shimadzu, Japão). A resolução espectral será de 4 cm-1com 120 varreduras e um comprimento de onda entre 4000-5000 cm-1 a temperatura ambiente.
A análise termogravimétrica das nanofibras de zeína será realizada com auxílio de um analisador termogravimétrico (TGA, TA-60WS, Shimadzu, Kyoto,Japão), com uma taxa de aquecimento de 10 °C.min−1 em uma faixa de30–600 °C e fluxo de nitrogênio de 50 mL.min−1. Uma amostra de 5 mg será aquecida em cápsulas de platina. Será utilizada uma cápsula de platina como referência.
O ângulo de contato com a água será avaliado de acordo com metodologia utilizada por Bohmer-Maas (2020). As medições serão realizadas com base no ângulo de contato por meio detensiômetro óptico (Theta Lite Modelo TL100; BiolinScientific, Suécia)a temperatura ambiente, e após, será feita a leitura em software OneAttension (BiolinScientific, Suécia). As nanofibras serão depositadas em uma folha de vidro, onde uma gota de água destilada (3,0 µL) será gotejada na superfície da membrana denanofibras. O ângulo de contato com água e o tempo para a absorção da mesma serão captados por uma câmera digital.
A eficiência de encapsulação será realizada segundo Fonseca (2020) por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa, para a medição dos principais compostos fenólicos. Serão pesadas 15mg de nanofibras, as quais serão homogeneizadas em 0,5mL de água e agitado em vórtice, sendo posteriormente centrifugado por 2 mina 1500x g. Em seguida será adicionado 30 µl de hexano, e agitado novamente no vórtice. A fração polar da solução será injetada no cromatógrafo(GCMS QP2010 Ultra, Shimadzu ™, Kyoto,Japão) equipado com injetor automático AOC-20i e NIST 2011 acoplado ao espectro de massa dentro de uma coluna capilar OV-5MS(Agilent J & W DB-Wax, EUA, 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). A temperatura de injeção será fixada em 200°C no modo Split (1:50), onde se utilizará gás hélio com fluxo de 1mL por min. Os parâmetros da análise serão desenvolvidos ao longo da estudo. Os resultados serão expressos em mg.g−1 de óleo essencial de tomilho para os compostos fenólicos encapsulado nas nanofibras. A eficiência de encapsulação será calculada por meio da fórmula que determina os compostos fenólicos livres (colocar aqui a formula) e a área de compostos fenólicos totais (colocar aqui a formula) no óleo essencial de tomilho.

Avaliação in vitro do efeito antimicrobiano de sachês de nanofibras de zeína com óleo essencial de tomilho
A avaliação do efeito antimicrobiano do óleo essencial de tomilho será realizada pela atividade antimicrobiana em ensaios de micro-atmosfera. Serão testados os efeitos antimicrobianos do composto sobre as cepas padrão das espécies de bactérias Escherichia coli (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832). A escolha destas espécies se deu pelo fato de possibilitar o teste do óleo essencial contra modelos de bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus) e Gram-negativas (Escherichia coli).

Reativação dos microrganismos
Os microrganismos utilizados no experimento serão mantidos sob congelamento em caldo Brain Heart Infusion(BHI) e glicerol (propano-1,2,3-triol) na proporção 3:1 (v:v). Para realizar a reativação, uma alçada dessas bactérias será transferida para caldo Soja Tripticaseína (TSB) ou BHI e incubadas em estufa durante 24 h a 37 ºC. Após, uma alçada desse crescimento será estriada em placas de Petri com meios seletivos, sendo ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) para Escherichia coli e ágar Baird-Paker para Sthapylococcusaureus, e incubadas por 24 h a 37°C, para o isolamento das colônias. Após este período, será extraída uma colônia e re-suspendida em solução salina (NaCl) 0,85%, a qual será padronizada na concentração 0,5 na escala de McFarland (1,5 x 108 UFC mL-1). Todos os ensaios serão realizados em triplicata.

Atividade antimicrobiana em micro-atmosfera ou em fase de vapor
A atividade antimicrobiana em micro-atmosfera será avaliada pela técnica proposta por Ghabraie et al. (2016) com pequenas modificações. Alíquotas de 0,1 mL de suspensões celulares dos microrganismos serão inoculados na superfície de placas com ágar BHI, TSA ou Muller-Hilton (MH) (15 mL/ camada de 6 mm). Na tampa de cada placa de petri serão posicionados discos de papel estéreis nos quais serão adicionadas diferentes quantidades do sachê contendo diferentes volumes de óleo essencial (100; 50; 25 e 12,5 μL). Posteriormente, as placas serão imediatamente fechadas de modo invertido (tampa para baixo), e incubadas a 37°C por 24 h. A ação antimicrobiana será expressa pelo percentual de redução na contagem celular (UFC) dos tratamentos com a substância antimicrobiana comparados com um controle contendo água estéril. A concentração da substância antimicrobiana será expressa em função do volume de substância e do espaço livre na placa ("π x r2 x h" = 3,14 x 4,52 x 1,5 = 95 cm3; 95 - 15 mL de ágar = 80 cm3 de espaço livre).

Avaliação in situ do efeito antimicrobiano de sachês de nanofibras de zeína com óleo essencial de tomilho em cortes cárneos acondicionados em bandejas de poliestireno
5.4.1Preparação do corte cárneo em bandeja de poliestireno com sachê de nanofibras adicionadas de óleo essencial de tomilho
Serão preparados três tratamentos, conforme descrito a seguir.
Tratamento 1: produto cárneo com adição de sachê sem adição de óleo essencial.
Tratamento 2: produto cárneo com adição de sachê com adição de óleo essencial.
Tratamento 3: produto cárneo sem o sachê, usado para o controle.

Análises microbiológicas
Os produtos após serem embalados de acordo com os tratamentos serão mantidos em temperatura de refrigeração (<7 ºC) por até 10 dias. A partir de cada um dos produtos será retirada uma amostra de 25 g em quatro tempos, logo após a elaboração do produto: um, três, sete e 10 dias após a elaboração dos produtos. Estas amostras serão submetidas às análises descritas a seguir. As análises serão selecionadas de acordo com Instrução Normativa n° 60 (BRASIL, 2019) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) do Ministério da Saúde, para carnes cruas, maturadas ou não, temperadas ou não, refrigeradas ou congeladas, embaladas a vácuo ou não, miúdos, toucinho e pele. As determinações microbiológicas, serão realizadas de acordo com as recomendações de Downes& Ito (2001) e SILVA et al. (2007).Serão coletadas 25 g de cada um dos produtos cárneos, os quais serão homogeneizados com 225 mL de água peptonada estéril (para análise de microrganismos mesófilos aeróbios e Escherichia coli) ou água peptonada tamponada (para pesquisa de Salmonella spp.). Em seguida, para as análises de bactérias mesófilas aeróbias e Escherichia coli

Com este estudo, espera-se obter sachês de nanofibras de zeína contendo óleo essencial de tomilho com ação antimicrobiana in vitro frente aos microrganismos Escherichia coli (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832) e que o corte cárneo acondicionado em bandejas de poliestireno com os sachês não apresentem contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, Escherichia coli e Salmonella spp. Ainda, espera-se que, a partir destes resultados qualitativos e quantitativos, seja criada uma alternativa promissora para a conservação de produtos cárneos, diminuindo riscos à saúde e atendendo as necessidades e expectativas dos consumidores.