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Espera-se conhecer a realidade do perfil microbiológico encontrado nas amostras lácteas que não sofreram tratamento térmico, considerando as bactérias ácido láticas e as potencialmente patogênicas, através das análises preconizadas pela legislação brasileira atual.
Acredita-se que os resultados possam servir como fonte de dados para futuras pesquisas e ações pontuais, tratando-se dos produtores de leite participantes, para que sejam realizadas adequações no sistema de produção, de acordo com o perfil microbiológico encontrado.
Pretende-se divulgar os resultados obtidos nesta pesquisa em artigos científicos e eventos relacionados à saúde pública e qualidade do leite, contribuindo para o conhecimento de estudantes, da comunidade científica e do público em geral.
Os resultados obtidos no presente projeto também farão parte da constituição de um portfólio de recursos genéticos microbiológicos, baseado em BAL, na Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora.

Local de trabalho:
O experimento será conduzido no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal da Universidade Federal de Pelotas (LIPOA-UFPel). Serão coletadas aproximadamente 20 amostras de leite e queijo não pasteurizados, por meio de busca ativa, em unidades de produção de leite, feiras de comercialização de produtos da agricultura familiar e estabelecimentos comerciais da região da bacia leiteira de Pelotas-RS.
Coleta das amostras:
Cada coleta de leite ou queijo será feita preferencialmente na sua embalagem de origem, ou de forma asséptica em um recipiente previamente esterilizado, em quantidade de no mínimo 100 ml ou 100 g. Essas amostras coletadas serão identificadas numericamente, acondicionadas em caixa isotérmica com gelo retornável, assegurando que fiquem em temperatura menor que 7°C e protegidas da luz, até que sejam encaminhadas em no máximo 48 horas ao LIPOA-UFPel, para realização das análises microbiológicas.
Durante o momento da coleta da amostra, será preenchida uma ficha de coleta, com intuito de numerar a amostra, identificar a origem da amostra láctea (município/propriedade), data de fabricação, modo e temperatura de acondicionamento no momento da coleta, nome da pessoa que coletou, tipo de produto, data de fabricação, etc

- Análises Microbiológicas:
Para as análises microbiológicas das amostras de leite e queijo para bactérias potencialmente patogênicas, serão realizadas as exigidas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Essas análises serão realizadas conforme a exigência para cada tipo de produto: para queijo será realizada a pesquisa de Salmonella spp., pesquisa de Listeria monocytogenes, contagem de Staphylococcus coagulase positiva, contagem de Escherichia coli e Contagem de Bolores e Leveduras e, no caso de leite cru, contagem de Enterobactérias (ANVISA, 2019).
A Contagem de Enterobactérias será realizada pelo método de plaqueamento conforme a ISO 21528-2:2004 e a contagem de E. coli de acordo com a metodologia APHA-9:2015. A contagem de Staphylococcus coagulase positiva será conforme a ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 e a Pesquisa de Salmonella, conforme a ISO 6579:2002/Corr 1:2004/Amd 1:2007. A pesquisa de Listeria monocytogenes será realizada conforme método ISO 11290-1:1996 amendment 1:2004 (DA SILVA et al., 2017). Quanto à contagem de Bolores e Leveduras, será realizada de acordo com a APHA 17.3:2015 (KIM et al., 2015).
Para as amostras líquidas, serão realizadas diluições seriadas conforme a recomendação da metodologia, e para amostras sólidas será realizada a homogeneização, em stomacher, de 25g da mesma em 225ml de água peptonada tamponada, considerando como diluição 10-1, para então dar seguimento às diluições.
Quanto ao isolamento de bactérias ácido láticas, será realizado conforme metodologia recomendada pela EMBRAPA (THIELMANN & ARCURI, 2000), da seguinte maneira:
Uma alíquota de vinte e cinco gramas ou mL da amostra láctea será adicionada a 225 mL de água peptonada 0,1%. Após homogeneização, serão realizadas diluições seriadas da amostra até a diluição 10-5. Para isolamento das bactérias ácido lácticas, com o auxílio de uma alça de Drigalski, será realizada a inoculação de 0,1ml de cada diluição na superfície dos meios MRS e M17. Quanto à incubação, duas placas de Ágar MRS de cada diluição serão incubadas a 30°C e as outras duas placas a 42-45°C, em anaerobiose por 72 horas. Para as placas com Agar M17: duas placas de cada diluição a 30°C e as outras placas a 42-45°C, em aerobiose por 48 horas. Após a contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC), serão isoladas colônias de diferentes características morfológicas, tais como cor, tamanho, forma (isolar no máximo 20 colônias por amostra (exemplo para leite: isolar no máximo 5 colônias para MRS a 30°C e 5 a 42°C, idem para agar M17). Observações quanto a características morfológicas, crescimento e abundância relativa (se é ou não a mais abundante na placa) destas colônias serão documentadas.
A identificação presuntiva dos microrganismos será realizada por meio da técnica de coloração de Gram e da reação da catalase. Os isolados Gram positivos que apresentarem catalase negativa serão considerados presuntivamente BAL e serão armazenados para posterior análise pela Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora. Uma vez isoladas e presuntivamente identificadas como BAL, as bactérias serão conservadas em meio Litmusmilk sob congelamento a -20 oC.
A documentação dos microrganismos será realizada utilizando livros tipo ata e planilhas do Excel, onde serão registradas informações, como características morfológicas de colônias e de células bacterianas, resultado da coloração de Gram e do teste da catalase, dentre outros dados.
Um backup de cada subgrupo de BAL será enviado sob refrigeração ao Laboratório de Microbiologia do Leite da Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora para análises subsequentes e conservação a longo termo em Coleção de Microrganismos Institucional da Embrapa.

- Documentação de dados
A identificação das amostras e os resultados obtidos a partir das análises laboratoriais serão registrados em atas e alimentarão uma planilha do programa Excel, para posterior análise e discussão.
As informações e resultados obtidos no presente estudo retornarão aos participantes que manifestarem interesse durante a coleta da amostra.

Espera-se conhecer a realidade do perfil microbiológico encontrado nas amostras lácteas que não sofreram tratamento térmico, considerando as bactérias ácido láticas e as potencialmente patogênicas, através das análises preconizadas pela legislação brasileira atual.
Acredita-se que os resultados possam servir como fonte de dados para futuras pesquisas e ações pontuais, tratando-se dos produtores de leite participantes, para que sejam realizadas adequações no sistema de produção, de acordo com o perfil microbiológico encontrado.
Pretende-se divulgar os resultados obtidos nesta pesquisa em artigos científicos e eventos relacionados à saúde pública e qualidade do leite, contribuindo para o conhecimento de estudantes, da comunidade científica e do público em geral.
Os resultados obtidos no presente projeto também farão parte da constituição de um portfólio de recursos genéticos microbiológicos, baseado em BAL, na Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora.