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Para um melhor entendimento dos problemas que são focos do projeto, os mesmos serão apresentados em função de cada subprojeto, conforme descrito a seguir.
Subprojeto I: Desenvolvimento de filme biodegradável de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) com potencial antimicrobiano para aplicação em queijos fatiados. Incluído na lista de “Generally Recognized as Safe” (GRAS) para uso como aditivo alimentar pela United States Food and Drug Administration (2020), o óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) é um exemplo de conservante natural que se destaca por sua atividade antimicrobiana e antioxidante (ESCOBAR et al., 2020). Os seus principais compostos, timol e carvacrol, são os principais responsáveis por exercer atividade antimicrobiana por meio de mecanismos, como aumento da permeabilidade celular, alteração dos ácidos graxos da membrana e efeito nas proteínas da membrana (SATO et al., 2007; KHORSHIDIAN, 2018).
No entanto, a concentração do OE aplicado diretamente na matriz de alimentos, como os queijos, deve ser considerada com cautela devido aos seus possíveis impactos negativos nas propriedades sensoriais do alimento (KHORSHIDIAN, 2018). Este problema pode ser solucionado ao se utilizar abordagens que tornem a liberação e o contato do OE com a matriz alimentícia gradual ou até mesmo indireto. Técnicas como a nanoencapsulação de OEs e/ou a incorporação destes em filmes comestíveis e revestimentos tem como objetivo proteger o alimento frente a contaminação microbiana, mantendo ativa por um longo período de tempo altas concentrações da substância na superfície do alimento (FAJARDO et al., 2010).
Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um filme biodegradável de amido com óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) encapsulado em nanofibras de zeína com potencial antimicrobiano para a aplicação em queijos fatiados.
Subprojeto II: Nanoemulsões de óleo essencial de tomilho: estabilidade, bioatividade, digestibilidade, toxicidade e aplicação em patê de frango. Pastas cárneas industrializadas conhecidas como “patês” são produtos de elevada demanda, porém em função da sua elevada perecibilidade necessitam da adição de conservantes químicos sintéticos como antioxidantes e antimicrobianos o que de certa forma vai contra a tendência atual de produtos com rótulo limpo. Assim a utilização de nanoemulsões com óleos essenciais em patês pode ser uma alternativa viável aos conservantes químicos sintéticos atendendo a demanda dos consumidores por produtos naturais e clean label.
Diante disso, o estudo propôs avaliar o efeito da utilização de diferentes tipos de surfactantes naturais no desenvolvimento de nanoemulsões de óleo essencial de tomilho, avaliar a estabilidade e o efeito tóxico em células humanas e animais e aplicar em um patê de carne de frango, possibilitando o desenvolvimento de um produto de rótulo limpo melhor para o meio ambiente e para a saúde humana.
Subprojeto III: Óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) encapsulado aplicado como ingrediente ativo em farinhas de trigo para utilização em massas alimentícias frescas. Para tentar minimizar os problemas citados e prolongar a vida útil de seus produtos, a indústria moageira vem fazendo uso de tecnologias alimentares como a adição de aditivos conservantes e antioxidantes às farinhas de trigo (REGO et al., 2021). No entanto, na contramão deste fato, uma das macrotendências destacadas pelo estudo Brasil Bakery & Confectionery Trends 2020 para a demanda de massas alimentícias é a “Naturalidade e Autenticidade”, sinalizando a valorização de opções de produtos percebidos como artesanais, naturais e sem aditivos artificiais (MORAES, 2010; VALDIVIESO-UGART, et al. 2019). Além disso, pesquisas sugerem que o uso de aditivos sintéticos e seu consumo prolongado podem levar a algumas reações alérgicas, efeitos colaterais, intoxicações, câncer e outras doenças degenerativas (SAUCEDA, 2011; BHAVANIRAMYA et al., 2019).No entanto, mesmo que estas técnicas já sejam conhecidas e utilizadas, ainda são escassos na literatura trabalhos que tenham abordado a aplicação de óleos essenciais como ingrediente ativo antioxidante e antimicrobiano em massas alimentícias frescas, justificando a realização deste trabalho.
Subprojeto IV: Extrato bioativo das flores da Clitoria ternatea: utilização em embalagens inteligentes e em óleos géis para aplicação em produtos cárneos.Neste estudo será realizada a aplicação do extrato bioativo da Clitoria ternatea em um filme com nanofibras, para ser utilizado como agente bioativo, indicador da mudança de pH, antimicrobiano e antioxidante e o extrato também será adicionado em oleogéis, para que estes possam ser utilizados como substitutos de gorduras saturadas e como agentes bioativos em produtos cárneos. Cabe ressaltar que na literatura não foram encontrados relatos da produção de embalagens ativas, inteligentes e oleogéis para aplicação em produtos cárneos utilizando o extrato bioativo das flores da Clitoria ternatea cultivadas no Brasil.

Para um melhor entendimento da metodologia, a mesma será apresentada em função de cada subprojeto, conforme descrito a seguir.
Metodologia do Subprojeto I: Desenvolvimento de filme biodegradável de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) com potencial antimicrobiano para aplicação em queijos fatiados. Os filmes de amido de batata serão produzidos pela técnica de casting proposta por Fonseca et al. (2018). As membranas de nanofibras serão produzidas por meio da técnica de electrospinning de acordo com Böhmer-Maas et al., (2020). A morfologia do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será avaliada de acordo com metodologia adaptada de Karim et al. (2021). A eficiência de encapsulação será realizada segundo metodologia de Bruni et al. (2020). Para analisar os grupos funcionais do óleo essencial de tomilho, do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína, será utilizada a técnica de espectrometria infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR). A estabilidade térmica do óleo essencial de tomilho, do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será determinada por análise termogravimétrica pelo uso de um analisador termogravimétrico (TGA, TA-60WS, Shimadzu, Kyoto,Japão). O ângulo de contato com a água (molhabilidade) do filme de amido, das nanofibras de zeína e do filme de amido com as nanofibras de zeína será avaliado de acordo com Bohmer-Maas et al. (2020). A espessura do filme de amido e do filme de amido com as nanofibras de zeína será determinada usando um micrômetro com precisão de 0,001 mm. A cor dos filmes de amido será determinada com um colorímetro Minolta operando com D65 (luz do dia) e usando os parâmetros de cor CIELab. O parâmetro de cor CIELab será determinado pelo atributo L* (branco: 100; preto: 0), a* e b*. A solubilidade dos filmes será calculada como g.100-1 g de matéria seca do filme solubilizado após imersão por 24 h em água a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C) (GONTARD, DUCHEZ, CUQ, & GUILBERT, 1994). A atividade antimicrobiana em micro-atmosfera será avaliada pela técnica proposta por Ghabraie et al. (2016). Disco difusão
A análise de disco difusão será realizada de acordo com o protocolo proposto pelo Manual Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (2015). Queijos fatiados com e sem filmes de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho serão mantidos em temperatura de refrigeração e submetidos a análise microbiológicas de Escherichia coli, Salmonella spp. L. monocytogenes e Staphylococcus coagulase positiva conforme IN n.º 60 (BRASIL, 2019). Considerando que o prazo de validade do queijo fatiado vendido a granel é de 3 dias, serão realizadas análises nos seguintes tempos: 24h, 72h e 7 dias.
Queijos fatiados com e sem filmes de amido com nanofibras de zeína e óleo essencial de tomilho serão submetidas a análise para detecção de enterotoxinas estafilocócicas A, B, C, D e E utilizando o kit comercial.
Metodologia Subprojeto II: Nanoemulsões de óleo essencial de tomilho: estabilidade, bioatividade, digestibilidade, toxicidade e aplicação em patê de frango. A fase oleosa da nanoemulsão será composta por óleo essencial de tomilho e óleo de girassol, enquanto a fase aquosa será composta por água Milli-Q e surfactantes. A metodologia utilizada seguirá as recomendações de Yang et al. (2022). Análise do tamanho de gota, índice de polidispersividade e potencial zeta determinada conforme Wan et al. (2019), A morfologia será examinada por microscopia eletrônica de varredura (JEOL, JSM - 6610LV, com microssonda de EDS). Para determinação das análises de pH será utilizado um potenciômetro (Digimed pHmetro DM-20) (AOAC, 2016). Para determinação de cor será utilizado um colorímetro Minolta CR 400. A capacidade antioxidante será realizada de acordo com o método DPPH seguindo Brand-Williams et al. (1995). A atividade antioxidante será determinada pelo método descrito por Re et al. (1999). A avaliação do efeito antimicrobiano será realizada por meio de quatro metodologias fenotípicas: disco difusão, atividade antimicrobiana em micro-atmosfera, concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima. Serão testados os efeitos antimicrobianos do composto sobre as cepas padrão das espécies de bactérias Escherichia coli (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832). Seguindo as metodologias descritas por CLSI (2012a, 2012b). A estabilidade térmica das nanoemulsões serão determinadas por um analisador termogravimétrico (TGA, TA-60WS, Shimadzu, Kyoto, Japão). A viabilidade celular será determinada pelo método do MTT (MOSMANN, 1983). A digestibilidade será realizada seguindo o protocolo proposto por Brodkorb et al. (2019). O produto cárneo será elaborado usando uma formulação padrão para fabricação de patês de frango. Os produtos mantidos em temperatura de refrigeração (≤ 7 ºC) por até sessenta dias. Estas amostras serão submetidas a avaliação frente aos microrganismos preconizados pela Instrução Normativa n° 161 de 1° de julho de 2022, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) vinculada ao Ministério da Saúde do Brasil (BRASIL, 2022), que são Salmonella spp. (ISO 6579-1, 2017), Escherichia coli (ISO 7251, 2005) e Microrganismos aeróbios mesofilos (ISO 4833,2013). O índice de acidez será determinado de acordo com a American Oil Chemists Society (AOCS) Ca 5a-40 (2003); A quantidade de aldeídos por p-anisidina será determinada de acordo com AOCS Cd 18-90 (1989); A determinação dos coeficientes de extinção específicos K232 e K270 será determinada de acordo com IOOC (2008).
Subprojeto III: Óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) encapsulado aplicado como ingrediente ativo em farinhas de trigo para utilização em massas alimentícias frescas. A caracterização da composição química do óleo essencial de tomilho será realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC/MS). A encapsulação do óleo essencial de tomilho será realizada segundo a metodologia descrita por Volic´ et al. (2022). A morfologia do óleo essencial de tomilho encapsulado em amido OSA liofilizado será avaliada de acordo com metodologia adaptada de Karim et al. (2021) por microscopia eletrônica. A eficiência de encapsulação será realizada no óleo essencial de tomilho encapsulado em amido OSA liofilizado segundo metodologia de Bruni et al. (2020). As propriedades termogravimétricas do óleo essencial de tomilho encapsulado em amido OSA liofilizado serão determinada por análise termogravimétrica pelo uso de um analisador termogravimétrico (TGA, TA-60WS, Shimadzu, Japão). A avaliação da atividade antioxidante das partículas ocorrerá por meio de dois métodos: DPPH e ABTS. A avaliação do efeito antimicrobiano do óleo essencial de tomilho encapsulado em amido OSA liofilizado será realizada pela atividade antimicrobiana em ensaios de micro-atmosfera e disco difusão. Serão testados os efeitos antimicrobianos do composto sobre as cepas padrão das espécies de bactérias Escherichia coli (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 10832) e para isolados de Penicillium spp., e Aspergillus spp. O preparo da massa será realizado de acordo com o descrito por Guerreiro (2021). A variação de cor das massas frescas será monitorada pelo do método CIELab (Commission internationale de l'éclairage), com a utilização do Colorímetro Minolta (Konika Minolta, CR 410) utilizando o iluminante D65. A análise de perda de massa será realizada por gravimetria pela pesagem em balança analítica de cada amostra no diferentes tempos de armazenamento. A análise de acidez será realizada por titulometria será realizada de acordo com a metodologia descrita pelo Instituto Adolfo Lutz (2008).A análise de umidade será realizada por gravimetria conforme descrito por IAL (2008). Avaliação in situ do efeito antioxidante do óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) encapsulado em amido OSA liofilizado em massas alimentícias frescas ocorrerá pelos métodos DPPH e ABTS in situ. Massas frescas produzidas com os aditivos comerciais e com o óleo essencial de tomilho encapsulado em amido OSA e liofilizado serão submetidas a análises microbiológicas de Salmonella spp., Bacillus cereus presuntivo, Estafilococos coagulase positiva, Escherichia coli e bolores e leveduras, conforme exigido pela Instrução Normativa 161 de 1° de julho de 2022 (BRASIL, 2022a).
Metodologia do Subprojeto IV: Extrato bioativo das flores da Clitoria ternatea: utilização em embalagens inteligentes e em óleos géis para aplicação em produtos cárneos. Para a produção de nanofibras será utilizado a técnica de electrospinning. A viscosidade das soluções serão avaliadas através de viscosímetro digital. A avaliação da morfologia será realizada por Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV).O diâmetro médio das nanofibras será medido através do MEV. As propriedades térmicas serão determinadas utilizando um calorímetro diferencial de varredura (DSC).Seguindo a metodologia de Bruni et al. (2018), para medir a hidrofobicidade (ângulo de contato) das nanofibras será determinado utilizando um goniômetro em temperatura ambiente (25 ± 2 °C). A eficiência de encapsulamento (EE) das nanofibras de amido de mandioca será determinada pela medição de compostos antociânicos, com os métodos descritos por Keawchaoon e Yoksan (2011). A atividade antioxidante in vitro das nanofibras contendo o extrato será determinada de acordo com os métodos de ABTS e DPPH. As propriedades termogravimétricas das nanofibras sensíveis ao pH serão avaliadas usando um analisador termogravimétrico (TGA TA-60WS, Shimadzu, Kyoto, Japão). O espectro das cores das nanofibras em diferentes pHs será determinado por meio de colorímetro, em localizações aleatórias. Os filmes serão obtidos pela técnica de casting. A morfologia será realizada por MEV. As demais informações das metodologias estão no projeto em anexo.

Os principais impactos do projeto estão relacionados ao desenvolvimento de novos produtos alimentícios com a aplicação de óleos essenciais e extratos vegetais através de tecnologias inovadoras de incorporação e manutenção destes compostos bioativos nestes produtos, buscando a manutenção da qualidade dos produtos e extensão da vida útil, o aproveitamento de matérias-primas de baixo valor agregado, a redução de resíduos gerados e a substituição parcial ou total de conservantes químicos sintéticos e de gordura saturada. Um filme biodegradável com óleo essencial de tomilho encapsulado, será, além de uma inovação, uma opção natural aos métodos convencionais de conservação, proporcionado seguridade aos consumidores com ação antimicrobiana frente aos microrganismos Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus coagulase positiva e inibição da produção de enterotoxinas estafilocócicas. E sua utilização em queijos fatiados torna-o uma alternativa promissora ecologicamente correta, diminuindo a produção de lixo gerado pelo uso de plásticos e aumentando o tempo de prateleira do produto além de torna-lo um alimento mais seguro ao consumidor.
No caso do patê a utilização da nanoemulsão de óleo essencial de tomilho com efeito antimicrobiano frente as bactérias Salmonella, Escherichia coli, microrganismos aeróbios mesófilos e Listeria monocytogenes e sem a perda da coloração causada pela redução de nitrito, mantendo ou até melhorando a coloração do produto, sem afetar a estabilidade físico-química tornaram este produto inovador e uma alternativa promissora para substituição de conservantes químicos artificiais em embutidos cárneos, diminuindo riscos à saúde e atendendo as necessidades e expectativas dos consumidores.
Espera-se obter o óleo de tomilho encapsulado em amido OSA e liofilizado como uma opção natural aos aditivos sintéticos convencionais de conservação, com ação antioxidante, e antimicrobiana para aplicação em farinhas de trigo e posterior produção de massas frescas. Com isso, espera-se também solucionar o problema de branqueamento nas massas alimentícias frescas através do uso de um ingrediente natural e seguro, garantindo a qualidade e a segurança dos produtos.O desenvolvimento de novas tecnologias na área de conservação de produtos alimentícios com intuito de manter a qualidade dos alimentos utilizando embalagens ativas, substâncias naturais bioativas e tecnologias inovadoras como a nonotecnologia é o foco deste estudo visando o desenvolvimento científico, tecnológico e de inovação. contribuindo para a sustentabilidade ambiental, econômica e social, fundamental para a fomentação da pesquisa científica, ampliação da visibilidade dos nossos resultados e atração de interesses nacionais e internacionais por pesquisas brasileiras.
Que os filmes multicamadas de nanofibras carregados com compostos antociânicos se mantenham com a coloração estável e com atividade antioxidante e antimicrobiana para serem utilizados como embalagem ativa, assim como que a incorporação das fibras com o bioativo, em embalagens inteligentes de alimentos, possa agir como um sensor da qualidade, mudando de cor na medida que o alimento se degrada e que seja possível produzir um alimento cárneo elevado onde sejam substituídas as gorduras saturadas por oleogéis com extrato da Clitoria ternatea.